蛋白質濃度測定常用比色法。其中，BCA法和Bradford法定量是最常用的蛋白濃度測定方法。每種蛋白質定量方法都有其局限性，在選擇蛋白質定量方法時，最需要考慮的特性是靈敏度、與樣品中常見物質的相容性(如洗滌劑、還原劑、抑制劑、鹽和緩沖液)、標準曲線線性和蛋白質之間的差異等。
蛋白定量BCA法和Bradford法對比
| BCA法 | Bradford法 | |
|---|---|---|
| 測定范圍 | 20–2000 μg/mL | 100-1500 μg/mL |
| 檢測原理 | 在堿性的條件下，蛋白質將堿性Cu(II)還原為Cu(I)。兩分子的二辛可寧酸（BCA）螯合一個Cu(I)，形成紫色的反應復合物。該復合物的水溶液在562nm處顯示強烈的吸光性 | 在試劑的酸性環境中，蛋白能與考馬斯染料結合。這導致染料的最大吸收發生位移，從紅棕色形式轉化為藍色形式。蛋白-染料結合物在595nm波長下吸收最大 |
| 優點 | 兼容大多數去垢劑 | 蛋白定量方法中，測定最快速，方法最簡單，且在室溫下進行 |
| 蛋白質間差異性小于Bradford法 | 與大多數鹽離子、溶劑、緩沖劑、硫醇、還原性物質和金屬螯合劑兼容 | |
| 缺點 | 能還原銅離子的物質也能造成顯色，影響定量的準確性 | 與通常用于溶解膜蛋白的高濃度去垢劑不兼容 |
| 與銅離子螯合的試劑，DTT 等常見還原劑和特定的單個氨基酸也會在BCA檢測中顯色（半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸） | 與BCA法相比，蛋白質之間的差異性較大 | |
| 需要孵育溫度以及時間的消耗 | - |
BCA法
試劑配制：
1、BCA試劑
A） 試劑A：分別稱取1%(w/v)BCA ，2%(w/v)Na2CO3·H2O，0.16%(w/v)Na2C4H4O6·2H2O，0.4%(w/v)NaOH，0.95%(w/v)NaHCO3，用NaOH或固體NaHCO3調節pH值至11.25。
B）試劑B：4%(w/v)CuSO4·5H2O。
C）BCA試劑：試劑A:試劑B=50:1,混合均勻。
2、牛血清蛋白標準（BSA）標準蛋白質母液：配制成5mg/ml的BSA標準溶液（配制溶液需與待測樣品溶液保持一致）。
實驗操作：
1、配制標準曲線待測樣品：用標液配置溶液稀釋BSA母液10倍，至濃度為0.5mg/ml。取96孔酶標板，按下表加入試劑
| 序號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.5mg/mlBSA溶液（μl） | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| 標液配置溶液（μl） | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
| 蛋白質濃度（mg/ml） | 0 | 0.025 | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
每份標樣分別加入BCA試劑200μl。
2、配制待測樣品：準確吸取20μl樣品溶液于酶標孔中，加入BCA試劑200μl。如待測樣品需稀釋，稀釋倍數需根據原始樣品濃度進行適當調整，一般保證稀釋后樣品濃度標曲濃度范圍內。
3、樣品處理：輕搖，于37℃保溫30-60min，冷卻至室溫。
4、測定：以空白為對照，在酶標儀上562nm處比色，以牛血清白蛋白含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。以標準曲線空白為對照，根據樣品的吸光值從標準曲線上查出樣品的蛋白質含量。
BCA法試劑
| 產品號 | 名稱 | 級別 | Cas | 規格 |
|---|---|---|---|---|
| B107658 | 2,2'-聯喹啉-4,4'-二甲酸二鈉(BCA) | 98% | 979-88-4 | 1g,5g,25g |
| S113834 | 碳酸鈉，一水 | ACS | 5968-11-6 | 1g,50g,250g |
| S111691 | 酒石酸鈉二元二水合物 | AR, ≥99% | 6106-24-7 | 100g,500g |
| S111518 | 氫氧化鈉 | AR,96%,顆粒狀 | 1310-73-2 | 500g,12*500g,20*500g |
| S112331 | 碳酸氫鈉 | AR,≥99.8% | 144-55-8 | 500g,12*500g,20*500g,10Kg |
| C112396 | 硫酸銅，五水 | AR,99% | 7758-99-8 | 500g,20*500g |
| A119741 | 牛血清白蛋白含量標準物質 | 98% | 9048-46-8 | 200mg |
Bradford法
試劑配制：
1、染色劑：0.01％考馬斯亮藍G250,8.5%磷酸和4.75%乙醇。
2、牛血清蛋白標準（BSA）標準蛋白質母液：配制成10mg/ml的BSA標準溶液（配制溶液需與待測樣品溶液保持一致）。
實驗操作：
1、配制標準曲線待測樣品：
A）在BSA母液中加入標液配置溶液，配置一組濃度分別為0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的BSA溶液。
| 序號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 10mg/mlBSA母液（μl） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 標液配置溶液（μl） | 1000 | 980 | 960 | 940 | 920 | 900 |
| 蛋白質濃度（mg/ml） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1 |
B）對于上述配制好的BSA溶液，再用P標液配置溶液分別稀釋10倍。
| 序號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 步驟A配置完成的BSA溶液（μl） | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 標液配置溶液（μl） | 900 | 900 | 900 | 900 | 900 | 900 |
| 蛋白質濃度（mg/ml） | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.1 |
C）分別移取50μl步驟B中配制好的一組待測標準BSA溶液，滴加到孔板中，再分別加入200μl考馬斯亮藍G250。靜置10min后檢測。
2、配制待測樣品：準確吸取50μl樣品溶液于孔板中，加入考馬斯亮藍G250試劑200μl。靜置10min后檢測。如待測樣品需稀釋，稀釋倍數需根據原始樣品濃度進行適當調整，一般保證稀釋后樣品濃度在0.1-1.0mg/ml。
3、用酶標儀在595nm波長下測定溶液的吸光度。以BSA含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。以標準曲線空白為對照，根據樣品的吸光值從標準曲線上查出樣品的蛋白質含量。
Bradford法試劑
| 產品號 | 名稱 | 級別 | Cas | 規格 |
|---|---|---|---|---|
| B104237 | 考馬斯亮藍G250 | AR | 6104-58-1 | 5g,10g,25g,100g,200g |
| P112024 | 磷酸 | AR, ≥85 wt. % in H2O | 7664-38-2 | 500ml,12*500ml,2.5L |
| A112717 | 乙醇(95%) | AR,95.0% | 64-17-5 | 500ml,12*500ml,20*500ml,4*5L,10L,25L |
| P196987 | PBS緩沖液 | 1× | - | 500ml |
| P196986 | PBS緩沖液 | 10× | - | 100ml,500ml,1L |
| A119741 | 牛血清白蛋白含量標準物質 | 98% | 9048-46-8 | 200mg |