罕見(jiàn)病，不止罕見(jiàn)！罕見(jiàn)病遠(yuǎn)超人們的想象：已知罕見(jiàn)病超過(guò)7000種，我國(guó)公布的罕見(jiàn)病目錄中已納入207種疾病，涉及遺傳（超過(guò)150種）、免疫（如自身免疫性腦炎、系統(tǒng)性硬化癥等10余種）及腫瘤相關(guān)疾病；全球約3億罕見(jiàn)病患者，我國(guó)罕見(jiàn)病群體規(guī)模約2000萬(wàn)人……近年來(lái)，斑馬魚(yú)因其與人類基因同源性高達(dá)87%、胚胎通體透明、基因編輯效率高、繁殖力強(qiáng)且適合高通量篩選等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，正在讓罕見(jiàn)病研究突破想象的邊界！
本期，我們介紹幾種環(huán)特生物可以為客戶提供的基于斑馬魚(yú)構(gòu)建的常用罕見(jiàn)病模型，包括Werner綜合征、先天性脊柱側(cè)凸、Acrofacial Dysostosis–Cincinnati 綜合征（辛辛那提型肢面發(fā)育不良，AFDCIN）、Dravet綜合征（DS）等，為罕見(jiàn)病藥物篩選、致病機(jī)制研究及基因治療探索提供科學(xué)的評(píng)價(jià)工具及科學(xué)依據(jù)，助力罕見(jiàn)病精準(zhǔn)診斷，讓罕見(jiàn)被看見(jiàn)！歡迎有需要的客戶垂詢！
01、構(gòu)建斑馬魚(yú)Werner綜合征模型
Werner綜合征（WS），是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，表現(xiàn)為加速衰老，但Wrn敲除小鼠無(wú)法重現(xiàn)患者表型，缺乏理想的脊椎動(dòng)物模型。
通過(guò)建立高效的脊椎動(dòng)物早衰模型——Werner綜合征特征的斑馬魚(yú)突變體，利用該模型進(jìn)行大規(guī)?；衔锖Y選，并在早衰模型、生理性衰老斑馬魚(yú)及人類細(xì)胞中驗(yàn)證，最后闡明有效藥物延緩衰老的分子機(jī)制。
wrn基因突變體斑馬魚(yú)在幼魚(yú)期就表現(xiàn)出與Werner綜合征患者相似的早衰特征，可作為高效的抗衰藥物篩選平臺(tái)，并在此基礎(chǔ)上從小規(guī)模篩選中發(fā)現(xiàn)抗癌藥物sapanisertib具有延緩衰老的潛力。
研究方法及指標(biāo)
1. 通過(guò)ENU誘變篩選，獲得wrn基因突變體（第5外顯子T→A突變，提前終止密碼子）；
2. 細(xì)胞衰老標(biāo)志：SA-β-Gal染色、p21/p53表達(dá)檢測(cè)；
3. DNA損傷：γH2AX免疫熒光；表觀遺傳改變；腸道屏障功能；炎癥反應(yīng)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；生存曲線、游泳活動(dòng)度追蹤等。
示意圖展示
參考文獻(xiàn)：J. Ma,Y. Chen,J. Song,Q. Ruan,L. Li, & L. Luo, Establishment and application of a zebrafish model of Werner syndrome identifies sapanisertib as a potential antiaging drug, Proc. Natl. Acad. Sci. 2025
圖1
圖2
02、構(gòu)建斑馬魚(yú)先天性脊柱側(cè)凸模型
先天性脊柱側(cè)彎，也稱先天性脊柱側(cè)凸（Congenital Scoliosis，CS），是由于胚胎在發(fā)育期間受各種原因（環(huán)境污染、基因突變、維生素缺乏、化學(xué)藥物因素以及病毒感染等）的影響，導(dǎo)致脊柱發(fā)育異常引起的脊柱畸形。
先天性脊柱側(cè)彎的發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒中約為（0.5~1）/1000，會(huì)影響嬰幼兒及青少年的骨骼發(fā)育，使身體變形，出現(xiàn)駝背、身材矮小扭曲的現(xiàn)象，嚴(yán)重者還可能影響心肺功能、腎臟功能、腸胃系統(tǒng)，心理等，甚至累及脊髓神經(jīng)造成癱瘓。已發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路等多個(gè)基因突變可導(dǎo)致CS，但大多數(shù)家族性或散發(fā)性病例的遺傳原因仍未知。
通過(guò)ENU化學(xué)誘變篩選，鑒定導(dǎo)致先天性脊柱側(cè)凸樣椎體畸形的基因；解析分子機(jī)制，闡明該基因在脊柱發(fā)育中的具體作用機(jī)制，揭示該基因調(diào)控的下游信號(hào)通路及其與疾病的關(guān)系。
研究結(jié)果顯示，dstyk突變導(dǎo)致CS樣表型，突變體魚(yú)脊索液泡生物發(fā)生缺陷，導(dǎo)致軸骨分割模式破壞，成年期嚴(yán)重脊柱側(cè)凸和駝背、椎體畸形。脊索液泡是特化的溶酶體相關(guān)細(xì)胞器（LROs），Dstyk通過(guò)mTORC1/TFEB通路調(diào)控溶酶體/液泡生物發(fā)生。mTORC1抑制劑Torin1可部分rescue突變體表型，提示mTOR通路為潛在治療靶點(diǎn)。
研究方法及指標(biāo)
1. 通過(guò)ENU誘變篩選，觀察體節(jié)縮短和脊柱彎曲表型，獲得smt（somite shorten）突變系，并定位到22號(hào)染色體dstyk基因；
2. 通過(guò)轉(zhuǎn)基因品系和活細(xì)胞成像、X-ray、micro-CT等連續(xù)觀察突變體魚(yú)脊索建立過(guò)程。
示意圖展示
參考文獻(xiàn)：Sun, X., Zhou, Y., Zhang, R. et al. Dstyk mutation leads to congenital scoliosis-like vertebral malformations in zebrafish via dysregulated mTORC1/TFEB pathway. Nat Commun 11, 479 (2020)
圖3
圖4
03、斑馬魚(yú)模型在AFDCIN綜合征中的應(yīng)用
Acrofacial Dysostosis–Cincinnati 綜合征（辛辛那提型肢面發(fā)育不良，AFDCIN）是一種罕見(jiàn)的先天性顱面和肢體骨骼發(fā)育異常綜合征，表現(xiàn)為頜面發(fā)育不良和肢體畸形。該疾病由 POLR1A 基因的致病變異引起，POLR1A 編碼 RNA 聚合酶 I 的最大亞基，參與核糖體 RNA 的轉(zhuǎn)錄。
通過(guò)斑馬魚(yú)模型，研究 POLR1A 基因突變?nèi)绾斡绊懞颂求w生物合成，進(jìn)而導(dǎo)致顱面和肢體骨骼發(fā)育異常。研究 Tp53 信號(hào)通路在 AFDCIN 發(fā)病機(jī)制中的具體貢獻(xiàn)，并探索是否存在Tp53獨(dú)立的機(jī)制。
在 polr1a–/– 突變體中，Tp53 依賴的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致顱面骨骼發(fā)育不良的重要機(jī)制。通過(guò)遺傳抑制 Tp53（生成 polr1a–/–; tp53–/– 雙突變體），可以部分改善早期胚胎發(fā)育中的細(xì)胞凋亡和顱面骨骼發(fā)育不良，但無(wú)法完全恢復(fù)。
研究方法
通過(guò)基因編輯技術(shù)構(gòu)建 POLR1A 基因敲除突變體（polr1a–/–）、 Tp53 突變體（tp53–/–） ，并生成雙突變體（polr1a–/–; tp53–/–）。
示意圖展示
參考文獻(xiàn)：Watt KEN, Neben CL, Hall S, et al. tp53-dependent and independent signaling underlies the pathogenesis and possible prevention of Acrofacial Dysostosis–Cincinnati type. Hum Mol Genet. 2018
圖5
圖6
04、斑馬魚(yú)模型在嬰兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇中的應(yīng)用
Dravet綜合征（DS）是一種由SCN1A基因突變引起的嚴(yán)重兒童期癲癇，其特征包括智力障礙、社交發(fā)展受損和持續(xù)的藥物難治性癲癇發(fā)作。SCN1A基因編碼的Nav1.1是一種電壓門(mén)控鈉通道，其突變與DS的發(fā)生密切相關(guān)。目前，DS的治療選擇有限，且大多數(shù)抗癲癇藥物（AEDs）對(duì)DS患者的療效不佳。
通過(guò)斑馬魚(yú)模型，篩選能夠改善DS相關(guān)癲癇表型的化合物，以期發(fā)現(xiàn)新的治療DS的藥物。scn1Lab突變體斑馬魚(yú)表現(xiàn)出與DS患者相似的癲癇表型，包括自發(fā)的癲癇發(fā)作、過(guò)度活躍和驚厥行為。通過(guò)高通量藥物篩選，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)克列咪唑（clemizole）能夠顯著抑制scn1Lab突變體的癲癇發(fā)作行為和電圖癲癇活動(dòng)。
研究方法
1. 利用化學(xué)誘變篩選得到了SCN1A基因突變的斑馬魚(yú)（scn1Lab），這些突變體表現(xiàn)出自發(fā)的異常電圖活動(dòng)、過(guò)度活躍和驚厥行為；
2. 設(shè)計(jì)了一個(gè)高通量藥物篩選策略，通過(guò)監(jiān)測(cè)斑馬魚(yú)的游泳行為和電圖活動(dòng)，篩選能夠抑制突變體癲癇發(fā)作的化合物。
結(jié)果展示
參考文獻(xiàn)：Baraban SC, Dinday MT, Hortopan GA. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 2013;4:2410.
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圖8