2022年1月25日，《自然》雜志發(fā)布一篇專(zhuān)欄文章《Seven technologies to watch in 2022》，基于基因編輯技術(shù)的診斷、完整版基因組、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析、量子模擬、精確基因組調(diào)控、靶向基因療法、空間多組學(xué)等獲評(píng)“有望改變2022年科學(xué)進(jìn)程的7大前沿技術(shù)”。
近年來(lái)，斑馬魚(yú)基因編輯技術(shù)在基因敲除、基因敲入、轉(zhuǎn)基因訂制及表觀遺傳修飾等方面的應(yīng)用日益廣泛，為基因組研究、研發(fā)新的癌癥治療方法、攻克遺傳性疾病等提供了全新的研究切入點(diǎn)及應(yīng)用方向，也讓我們見(jiàn)證著生物學(xué)上的突破對(duì)人類(lèi)生命質(zhì)量提高的巨大影響力。
環(huán)特生物，依托10余年的斑馬魚(yú)基因編輯經(jīng)驗(yàn)，深度挖掘、創(chuàng)新斑馬魚(yú)技術(shù)的應(yīng)用場(chǎng)景，已為150多家單位提供斑馬魚(yú)基因敲入、敲除、敲降、定制轉(zhuǎn)基因技術(shù)服務(wù)及斑馬魚(yú)疾病模型開(kāi)發(fā)等專(zhuān)業(yè)的基因編輯技術(shù)服務(wù)，累計(jì)完成350例以上基因編輯品系，測(cè)試超過(guò)1000個(gè)gRNA靶點(diǎn)，推動(dòng)了諸多前沿基因功能研究取得了突破性進(jìn)展，為斑馬魚(yú)基因編輯技術(shù)在更加廣泛的研究領(lǐng)域內(nèi)的創(chuàng)新性應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。
本期我們繼續(xù)為大家分享斑馬魚(yú)基因編輯服務(wù)案例之二——
● 服務(wù)案例6.H2S通過(guò)斑馬魚(yú)的NOS/NO途徑促進(jìn)發(fā)育性腦血管生成
研究背景：硫化氫（H2S）與一氧化氮（NO）和一氧化碳一起被認(rèn)為是氣體遞質(zhì)家族的第三個(gè)成員。據(jù)報(bào)道，H2 S通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和管狀結(jié)構(gòu)的形成來(lái)誘導(dǎo)血管生成。這些研究是在細(xì)胞培養(yǎng)、小鼠基質(zhì)凝膠栓試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⒋笫髠谟夏Ｐ突虼笫蠛笾毖Ｐ偷臈l件下進(jìn)行的。新近的體內(nèi)研究表明H2S在肌肉血管生成中的生理重要性。然而，內(nèi)源性H2S在發(fā)育過(guò)程中對(duì)腦血管生成的重要性尚不清楚。因此，我們旨在確定H2S在腦血管發(fā)育中的作用。
研究目的：確定H2S在腦血管發(fā)育中的作用。
研究方法：使用嗎啡啉和Cas9介導(dǎo)的基因編輯，敲除cbs和cth,損害斑馬魚(yú)幼魚(yú)的腦血管發(fā)育。緩慢釋放的H2S供體GY4137孵育可緩解cbs和cth變形劑的腦血管發(fā)育缺陷。對(duì)中腦血管網(wǎng)絡(luò)的定量分析表明，H2S在不影響腦血管系統(tǒng)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的情況下促進(jìn)血管生成。機(jī)械上，cbs和cth變形劑中的一氧化氮合酶2a（nos2a）表達(dá)和NO生成均降低。通過(guò)將cbs或cth-MO與全長(zhǎng)斑馬魚(yú)nos2a mRNA共注射，nos2a的過(guò)度表達(dá)減輕了cbs和cth變體的腦血管發(fā)育缺陷。
研究結(jié)論：H2S通過(guò)斑馬魚(yú)體內(nèi)NOS/NO途徑促進(jìn)腦發(fā)育血管生成。
研究成果出處：Jiang, Weiqing et al. H2S promotes developmental brain angiogenesis via the NOS/NO pathway in zebrafish. 2021
● 服務(wù)案例7.非典型蛋白酶激活受體1（part1）調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)的淋巴分化
研究背景：PAR家族，尤其是part1，是血管止血、血栓形成和炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)
研究目的：探索par1在斑馬魚(yú)胚胎淋巴分化調(diào)控中的作用。
研究方法：
（1）制備斑馬魚(yú)par1和gnai2a突變體；
（2）將par1突變體與Tg(lyve1b:dsRed;flk1:EGFP)系雜交標(biāo)記靜脈血管和淋巴管出芽；
（3）通過(guò)WISH分析gnai2同源基因(gnai2a和gnai2b)在斑馬魚(yú)胚胎中的表達(dá)模式；
（4）在Tg(fli1a:EGFP)胚胎中使用抗prox1抗體進(jìn)行54hpf的免疫染色實(shí)驗(yàn)
研究結(jié)論：mmp13b-par1-gnai2a軸通過(guò)促進(jìn)Vegfc/Flt4/Erk1/2信號(hào)通路調(diào)控斑馬魚(yú)淋巴管生成過(guò)程。
研究成果出處：Daoxi Lei,Xiuru Zhang,Muhammad Abdul Rouf,Yoga Mahendra,Lin Wen,Yan Li,Xiaojuan ZhangLi Li,Luming Wang,Tao Zhang,Guixue Wang,Yeqi Wang,Noncanonical protease-activated receptor 1 regulates lymphatic differentiation in zebrafish, 2021
● 服務(wù)案例8. klf6a-tagln2軸通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞重排和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)來(lái)驅(qū)動(dòng)斑馬魚(yú)血管修剪
研究背景：血管重構(gòu)是血管生理和病理的關(guān)鍵。由血管生成形成的原始血管叢，隨后經(jīng)過(guò)廣泛的血管重構(gòu)，建立起具有功能和層次的分支血管網(wǎng)絡(luò)。
研究目的：進(jìn)一步了解大直徑血管的修剪。
研究方法：
（1）利用基因編輯技術(shù)制備klf6a/tagln2 mut和KI品系；
（2）三卡因0.06 mg/ mL處理至72 hpf；
（3）斑馬魚(yú)胚胎的延時(shí)實(shí)時(shí)成像；
（4）計(jì)算紅細(xì)胞流動(dòng)速度
研究結(jié)論：發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)胚胎尾靜脈叢的腹側(cè)毛細(xì)血管被修剪成大直徑的尾靜脈血管，klf6a-tagln2軸通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞重排列和連接重構(gòu)來(lái)調(diào)控血管修剪。
研究成果出處：Lin Wen, Tao Zhang, Jinxuan Wang, Xuepu Jin, Muhammad Abdul Rouf, Desha Luo, Yuan Zhu, Daoxi Lei, Hans Gregersen, Yeqi Wang, Guixue Wang. The blood flow-klf6a-tagln2 axis drives vessel pruning in zebrafish by regulating endothelial cell rearrangement and actin cytoskeleton dynamics，2021
● 服務(wù)案例9.BDE-99通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子six7破壞斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的光感受器模式
研究背景：多溴聯(lián)苯醚 (PBDEs)在水，室內(nèi)空氣，和日常食物中均可檢測(cè)到，其暴露與糖尿病肥胖和神經(jīng)發(fā)育缺陷等代謝性疾病密切相關(guān)。BDE-99是商用多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)主要成分(占42-48%)。視覺(jué)障礙是一種標(biāo)志性的新興毒理學(xué)效應(yīng)，多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)會(huì)損害斑馬魚(yú)的視力發(fā)育，甲狀腺激素(TH)信號(hào)傳導(dǎo)被懷疑是主要貢獻(xiàn)者，six7在硬骨魚(yú)的MW 錐體分化中發(fā)揮了重要作用，而外源性T3處理可以顯著抑制six7的表達(dá)。這表明其與TH之間的潛在關(guān)系。
研究目的：通過(guò)對(duì)six7在感光器圖案化過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用，研究PBDEs 視覺(jué)毒性的機(jī)制。
研究方法：在BDE-99濃度量化后，進(jìn)行斑馬魚(yú)的視覺(jué)引導(dǎo)的行為測(cè)試。通過(guò)RNA 提取和、qRT-PCR 分析、冷凍切片和 H&E 染色以及斑馬魚(yú)中 six7 表達(dá)的敲除和過(guò)表達(dá)來(lái)進(jìn)行研究。
研究結(jié)論：
（1）BDE-99 會(huì)損害視網(wǎng)膜中的多個(gè)光感受器，并在受精后 120 小時(shí)干擾斑馬魚(yú)幼魚(yú)色覺(jué)引導(dǎo)的行為；
（2）光感受器的損傷無(wú)法通過(guò)引入TH受體拮抗劑來(lái)完全恢復(fù)改變，這表明其他潛在調(diào)節(jié)因素的參與；
（3）通過(guò)調(diào)節(jié)中波長(zhǎng)視蛋白的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑 six7 的表達(dá)，我們證明了在 BDE-99 的破壞中，是 six7 而不是 THs主導(dǎo)了感光器圖案化。該工作促進(jìn)了對(duì) six7 在感光器圖案化過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用的理解，并提出了 PBDEs視覺(jué)毒性的新機(jī)制。
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研究成果出處：Wei S, Chen F, Xu T. BDE-99 Disrupts the Photoreceptor Patterning of Zebrafish Larvae via Transcription Factor six7 . 2022