步驟1：光周期調(diào)控GmCDPK38的表達(dá)；
步驟2：GmCDPK38的遺傳變異與大豆開花時間和對斜紋夜蛾（CCW）的抗性相關(guān)；
步驟3：CRISPR/Cas9介導(dǎo)的GmCDPK38 Hap3靶向突變導(dǎo)致大豆開花延遲，并增強對CCW的抗性；
步驟4：利用磷酸化蛋白質(zhì)組篩選GmCDPK38的下游底物；
步驟5：RNA-seq分析揭示GmCDPK38影響的基因表達(dá)；
步驟6：gmcdpk38突變體中多種代謝產(chǎn)物的積累增加；
步驟7：GmCDPK38翻譯后調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸合酶；
步驟8：GmCDPK38是一個馴化基因，抗性的Hap2可能是一個人工選擇靶點。
研究結(jié)果
1. 光周期調(diào)控GmCDPK38的表達(dá)
GmCDPK38是鈣依賴性蛋白激酶第IV亞家族成員。通過光周期實驗發(fā)現(xiàn)GmCDPK38在長日照（LD）條件下的表達(dá)水平大于短日照（SD）。隨后通過分析GmCDPK38的日表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在LD條件下，GmCDPK38的表達(dá)量在白天減少，夜間增加。在SD條件下觀察到該基因存在相同的表達(dá)模式，但其轉(zhuǎn)錄的幅度和豐度低于LD。這些結(jié)果表明，GmCDPK38的表達(dá)受光周期調(diào)節(jié)，在LD條件下表達(dá)量更高（圖1）。
圖1 GmCDPK38表達(dá)分析
2. GmCDPK38的遺傳變異與大豆開花時間和對斜紋夜蛾（CCW）的抗性相關(guān)
分析了272株栽培大豆中的GmCDPK38序列，在至少7種環(huán)境中，18個多態(tài)性位點與開花時間的變化顯著相關(guān)。其中，含單倍型2（Hap2）的大豆的開花時間明顯晚于含Hap3。此外，具有晚花Hap2的栽培大豆對CCW更具抗性。在LD和SD條件下，Hap2中的GmCDPK38表達(dá)顯著低于Hap3，其啟動子活性也低于Hap3。綜上，GmCDPK38可能在花期和抗蟲性方面發(fā)揮作用（圖2）。
圖2 大豆GmCDPK38單倍型分析
3. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的GmCDPK38 Hap3靶向突變導(dǎo)致大豆開花延遲，并增強對CCW的抗性
大豆品種Jack中的GmCDPK38序列屬于Hap3。比較野生型（WT）Jack植株和gmcdpk38突變體的開花時間，發(fā)現(xiàn)突變體的開花時間晚于WT植株。此外，在LD條件下評估gmcdpk38突變體和WT植株的抗蟲性，實驗表明GmCDPK38的突變提高了大豆對CCW的抗性（圖3）。
圖3 T3 gmcdpk38突變體的表型鑒定
4. 利用磷酸化蛋白質(zhì)組篩選GmCDPK38的下游底物
通過定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析檢測WT植株和gmcdpk38突變體中的磷酸蛋白。數(shù)據(jù)顯示了一系列可能的GmCDPK38激酶下游底物，推斷GmCDPK38可能通過影響這些蛋白質(zhì)的磷酸化來介導(dǎo)大豆開花和抗蟲性（圖4）。
圖4 磷酸蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)總結(jié)
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