編者按
甾體生物堿及其糖基化形式（Steroidal alkaloids and their glycosylated forms，SGAs）是茄科植物中產(chǎn)生的一類特殊化代謝產(chǎn)物，對植物病原體和食草動物具有防御作用。
迄今為止，在番茄中已經(jīng)檢測到近100種甾體生物堿，其中α-番茄堿是葉片、花蕾和綠色果實組織中的主要SGA。
食物中高濃度的α-番茄紅素在食用時會引起苦味和喉嚨灼熱感。同時在番茄中，由于GAME1(一種進行番茄紅素半乳糖基化的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)的沉默，番茄紅素的水平增加，會導(dǎo)致毒性表型，如生長遲緩、莖栓化以及葉和果實形態(tài)畸變等。
因此在果實馴化和育種過程中，選擇苦味較低、口感較好、毒性較低、SGAs含量較低的番茄果實具有重要意義。
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2021年3月來自以色列魏茲曼科學(xué)研究所的研究人員在Nature Plants 發(fā)表了題為The GORKY glycoalkaloid transporter is indispensable for preventing tomato bitterness的研究論文。
在這項研究中，作者破譯了成熟番茄果實保持低α-番茄紅素水平保持不苦澀的分子機制。發(fā)現(xiàn)GORKY (俄語中“苦”的意思)是NPF轉(zhuǎn)運蛋白的一員，其對于防止成熟番茄果實中的高α-番茄紅素水平至關(guān)重要。在成熟過程中，GORKY負責(zé)將α-番茄堿和其他甾體生物堿從液泡轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這有助于整個α-番茄紅素庫代謝轉(zhuǎn)化為非苦味形式，從而使水果更加可口。
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【技術(shù)方法】植物非靶代謝組學(xué)、靶向代謝組學(xué)、遺傳作圖等方法
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【主要結(jié)果】
一、NPF轉(zhuǎn)運蛋白映射到與水果苦味相關(guān)的基因組區(qū)域
首先，作者篩選到一個在成熟果實中具有強苦味的番茄野生近緣品系 (EA03058)，為了研究代謝物組成的變化和EA03058苦味的相關(guān)性，他們使用代謝組學(xué)分析方法描述了水果提取物在不同發(fā)育階段的代謝物，通過主成分分析PCA描述了EA03058和非苦味樣品之間的主要差異，發(fā)現(xiàn)在果實成熟發(fā)育的破色期 （breaker stage） 和紅熟期 （red stage） 有比較打的差異 (圖1b)。
作者提出SGAs組成的變化可能是導(dǎo)致水果味道變化的原因。EA03058品系紅熟期的果實中含有高水平的α-番茄堿，同時成熟果實中七葉皂苷A含量顯著降低，這與非苦味果實樣品之間存在著巨大差異 (圖1c)。
圖1. 番茄果實發(fā)育和成熟過程中SGA成分的“代謝轉(zhuǎn)變”
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為了定位高α-番茄紅素的苦味基因位點，研究人員將EA03058與野生種Solanum pimpinellifolium和Heinz1706 (作為參考基因組) 雜交， 產(chǎn)生了兩個番茄定位群體 (圖2a)。
為了進一步縮小該區(qū)域的基因數(shù)量，后使用SNP進行補充，并通過精細定位將苦味基因位點減少到56個候選基因(圖2b)。同時利用150個品系的重測序的比較分析發(fā)現(xiàn)了20個SNP和一個612bp的缺失，這些SNP沒有出現(xiàn)在Heinz1706和其他重新測序的材料中。612bp的缺失位于NPF轉(zhuǎn)運蛋白同源基因的最后一個外顯子。作者將這個基因命名為GORKY (圖2c)。
另外9個含有GORKY缺失的材料 (包括EA03058) 的SGA檢測結(jié)果顯示，與WT成熟果實相比，α-番茄堿、羥基番茄堿、乙酰氧番茄堿和其他SGA途徑中間體的水平顯著更高，而七葉皂苷A的水平顯著降低，表明GORKY可能參與了α-番茄紅素向七葉皂苷甲的轉(zhuǎn)化。后者在果實成熟后積累在紅色果實中。這與GORKY在成熟果實中的表達水平最高，在葉和花組織中的表達水平較低(圖2d)一致。
圖2. 通過繪制“苦味”特征來發(fā)現(xiàn)GORKY候選基因
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二、番茄中GORKY的功能特性
為了探究GORKY的功能特性，研究人員構(gòu)建了GORKY功能缺失植株，再對SGA進行檢測分析(圖3b)，進一步證實了GORKY能夠降低紅色成熟果實中的苦味。
三個GORKY功能缺失系的紅色成熟果實提取物的SGA在很大程度上類似于含有GORKY基因缺失的原始“苦味”品系(圖3c-e)。在檢測的所有三個突變等位基因的成熟果實中，α-番茄堿和脫氫番茄堿以及其他SGA途徑中間體(例如乙酰氧番茄堿、羥基番茄堿和乙酰氧羥基番茄堿)的水平大量增加，而七葉皂苷A的水平顯著降低(圖3d、e)。
圖3. GORKY活性的改變導(dǎo)致α-番茄紅素在成熟果實中的過度積累
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為進一步探究GORKY的功能特性，作者又構(gòu)建了GORKY高表達植物GORKY-Ox并分析了三個獨立轉(zhuǎn)化系中的SGAs水平，顯示與WT葉相比表達增加了>200倍(圖4a)。
有趣的是，通常在綠色組織中檢測不到的“成熟”SGA七葉皂苷A在GORKY-Ox葉片中積累(圖4b)。此外，GORKY-Ox系也會影響植物的生長和發(fā)育，因為它們也表現(xiàn)出矮化和器官形態(tài)上的一些改變(圖4c)。
另外，作者也研究了GORKY功能性拷貝的過表達是否會恢復(fù)前人描述的“苦味”野生番茄品種EA07290的SGA圖譜(圖4d)。與EA07290本身相比，紅色成熟果實的SGA檢測結(jié)果顯示出明顯更高水平的七葉皂苷A (圖4e)。在這些過表達系的果實中，α-番茄堿和脫氫番茄堿的水平顯著較低，這表明表達GORKY的功能性拷貝能夠緩解“苦”的紅色成熟果實化學(xué)表型(圖4f，g)。
圖4. GORKY過表達導(dǎo)致SGA途徑中間體的過度積累