??? 克隆鑒定是分子克隆實(shí)驗(yàn)中最常進(jìn)行的工作之一。如果能掌握正確的方法，盡量減少克隆鑒定所需的等待時(shí)間以及工作量，將為分子生物工作者節(jié)約更多的寶貴時(shí)間、精力并加快實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度，這就是經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)者常說(shuō)的合理的“偷懶”（或類(lèi)似的說(shuō)法）。以下總結(jié)了幾種可以省時(shí)省力進(jìn)行克隆鑒定的“偷懶”竅門(mén)，以期對(duì)要經(jīng)常進(jìn)行此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的分子生物工作者有些幫助。
“偷懶”竅門(mén)一：多利用PCR鑒定進(jìn)行克隆鑒定
“偷懶”竅門(mén)二：直接用菌落及菌液進(jìn)行PCR鑒定
“偷懶”竅門(mén)一：多利用PCR鑒定進(jìn)行克隆鑒定
??? 克隆鑒定最常用到酶切鑒定，PCR鑒定兩種方法。
??? 酶切鑒定：此方法是利用最終克隆質(zhì)粒特有的酶切圖譜進(jìn)行篩選，需要先進(jìn)行搖菌、抽提質(zhì)粒、酶切消化、電泳幾個(gè)步驟，步驟多，時(shí)間長(zhǎng)，出差錯(cuò)的可能性也高（質(zhì)粒抽提成功與否，酶切消化完全與否都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果）。而且酶切鑒定受酶切圖譜及內(nèi)切酶的限制：如果找不到易于區(qū)別陽(yáng)性、陰性克隆的酶切結(jié)果，或者無(wú)合適的內(nèi)切酶可用，酶切鑒定實(shí)行起來(lái)就有困難。因此分子實(shí)驗(yàn)室的老手們常常都不把酶切鑒定列為優(yōu)先的選擇，而是作為一種補(bǔ)充手段或者進(jìn)一步驗(yàn)證的方法。
PCR鑒定：而利用PCR進(jìn)行克隆鑒定所基于的原理有兩種情況：
??? 1. 利用分別結(jié)合載體及外源DNA序列的特異引物充當(dāng)上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，外源DNA正確插入后的最終克隆會(huì)擴(kuò)增出預(yù)計(jì)大小的擴(kuò)增帶（原理示意圖見(jiàn)圖一）。
圖一：克隆PCR鑒定原理之一
??? 2. 利用結(jié)合于載體上克隆位點(diǎn)兩側(cè)的上、下游引物對(duì)篩選克隆進(jìn)行PCR，通過(guò)擴(kuò)增條帶的大小來(lái)判斷是否有外源DNA插入，此時(shí)不必知道外源DNA的序列，可用來(lái)鑒定未知序列的外源DNA的克隆（原理示意圖見(jiàn)圖二）。
圖二：克隆PCR鑒定原理之二 
??? PCR鑒定可以用抽提后的質(zhì)粒DNA充當(dāng)模板開(kāi)始PCR擴(kuò)增，也可以直接以菌落或少量菌液（見(jiàn)竅門(mén)二）為模板開(kāi)始PCR擴(kuò)增，后一種情況只需經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，電泳步驟就可以得到鑒定結(jié)果，步驟簡(jiǎn)單、快捷，而且可同時(shí)篩選數(shù)十甚至數(shù)百個(gè)克隆，這些優(yōu)點(diǎn)讓PCR鑒定成為很多分子生物工作者首選的克隆鑒定方法。
需要注意的PCR假陽(yáng)性條帶：?
???PCR鑒定中的最大問(wèn)題當(dāng)屬PCR的假陽(yáng)性，假陽(yáng)性產(chǎn)生的主要原因有兩種：
1. 由于用于轉(zhuǎn)化的連接產(chǎn)物DNA會(huì)殘留在平板上，使用菌落做PCR模板時(shí)，常會(huì)沾染連接產(chǎn)物DNA而導(dǎo)致假陽(yáng)性。
2. 引物的非特異性結(jié)合導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增條帶（特別有當(dāng)非特異性擴(kuò)增條帶大小與預(yù)計(jì)條帶大小相差不多時(shí)，對(duì)結(jié)果判斷影響很大）。
??? 幸運(yùn)的是真正的陽(yáng)性克隆其PCR擴(kuò)增條帶產(chǎn)量非常的高（這是由于陽(yáng)性克隆中的PCR模板是質(zhì)粒的原因），使得陽(yáng)性克隆所產(chǎn)生的擴(kuò)增帶在絕大多數(shù)情況下較上面兩種情況所產(chǎn)生的擴(kuò)增帶要明亮很多（參見(jiàn)竅門(mén)三中的圖四），較容易得出正確的判斷。
??? 使用少量培養(yǎng)后的菌液代替菌落進(jìn)行PCR鑒定會(huì)有效減少第一種情況所導(dǎo)致的假陽(yáng)性（具體方法見(jiàn)竅門(mén)二）。