肝細(xì)胞癌 (HCC) 是最常見的肝癌類型，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）在內(nèi)的多種致病因素均可促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，但到目前為止，肝癌的治療手段十分有限。最近報(bào)道表明，膳食膽固醇或從頭合成的膽固醇可通過合成膽汁酸(BAs)促進(jìn)HCC發(fā)生。線粒體膽固醇主要通過甾體合成急性調(diào)節(jié)蛋白1（STARD1）進(jìn)行調(diào)控，但其對(duì)HCC發(fā)展的作用尚不清楚。巴塞羅那生物醫(yī)學(xué)研究所Jose C. Fernandez-Checa研究團(tuán)隊(duì)研究報(bào)道了STARD1刺激膽汁酸產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)NASH向HCC發(fā)展。相關(guān)成果發(fā)表于《Journal of Hepatology》。
NASH 驅(qū)動(dòng)的HCC患者STARD1 表達(dá)增加和膽汁酸（BA）水平異常
盡管肝臟中STARD1基礎(chǔ)表達(dá)較低，但在NASH患者中STARD1表達(dá)上調(diào)，而在單純脂肪變性的受試者中無變化。STARD1在NASH驅(qū)動(dòng)的HCC患者中尚未被探討，基于此，該研究對(duì)NASH驅(qū)動(dòng)的HCC患者STARD1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NASH驅(qū)動(dòng)的HCC患者肝臟中STAR基因轉(zhuǎn)錄水平和STARD1蛋白水平增加。肝切片免疫組化顯示STARD1染色增強(qiáng)，且肝臟游離膽固醇水平升高。
此外，肝癌樣本中HMGCS、HMGCR和SREBP2（膽固醇穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子）表達(dá)增加。盡管SREBP2受到膽固醇負(fù)反饋調(diào)控，但本研究探討了膽固醇升高同時(shí)伴隨 SREBP2 激活與TNFR1-Caspase-2-S1P-SREBP2 軸觸發(fā)的難治性反饋回路有關(guān)。qPCR結(jié)果顯示HCC患者CASP-2和MBPTS1 (S1P)表達(dá)增加，同時(shí)HIF1A和靶基因（PDK1、SLC2A1（Glut 1）、SLC2A3（Glut 3）和 SLC25A11（2-OGC））表達(dá)增加，這些基因可以調(diào)節(jié)HCC中線粒體GSH穩(wěn)態(tài)。
接下來本研究檢測(cè)了HCC患者肝臟BA水平。與對(duì)照組相比，HCC患者肝臟總BA水平增加2倍，這與CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、CYP7B1、CYP7A1、CYP27A1表達(dá)增加一致，這表明BA合成的經(jīng)典和替代途徑被激活。
圖1. NASH驅(qū)動(dòng)的HCC患者STARD1表達(dá)增加
膽固醇促進(jìn)NASH驅(qū)動(dòng)的HCC小鼠疾病進(jìn)展并誘導(dǎo)STARD1表達(dá)
盡管越來越多的證據(jù)表明膽固醇與HCC發(fā)展有關(guān)，但也有研究表明膽固醇在HCC中具有抑制腫瘤作用。鑒于單獨(dú)高脂飲食（HFD）不會(huì)誘導(dǎo)NASH以及二乙基亞硝胺 (DEN) 聯(lián)合HFD 喂養(yǎng)不能完全模擬NASH 驅(qū)動(dòng)的HCC，本研究通過補(bǔ)充膽固醇的HFD飲食（HFHC）聯(lián)合DEN預(yù)處理建立飲食 NASH 驅(qū)動(dòng)的HCC小鼠模型。這種飲食已被證明會(huì)誘發(fā)NASH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與DEN+HFD小鼠相比，DEN+HFHC小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT) 水平更高，同時(shí)肝臟膽固醇含量增加和Hmgcr表達(dá)降低。脂肪變性程度和TG水平在DEN+HFD和DEN+HFHC小鼠之間相似，但與DEN+HFD小鼠相比，DEN+HFHC小鼠肝纖維化更為嚴(yán)重。
此外，DEN+HFHC小鼠肝臟切片顯示游離膽固醇水平升高，線粒體中也存在游離膽固醇。Tnfa 和 Ccl2表達(dá)升高表明，DEN+HFHC組肝臟炎癥增加。重要的是，喂養(yǎng)24周后DEN+HFD 小鼠出現(xiàn)腫瘤變化，但DEN+HFHC小鼠腫瘤數(shù)量和最大面積變化更大，喂養(yǎng)32周后腫瘤數(shù)量和最大面積進(jìn)一步增加。腫瘤負(fù)荷增加了血清Afp水平，尤其是在DEN+HFHC組，并且這Afp和Yap（HCC標(biāo)記物）表達(dá)升高。同時(shí)DEN+HFHC誘導(dǎo)肝臟Stard1表達(dá)，Stard1在HCC腫瘤中優(yōu)先表達(dá)。與DEN+HFD小鼠相比，DEN+HFHC小鼠中與腫瘤發(fā)生（Gpc3、Ly6d和Golm1）、細(xì)胞粘附和相互作用（Birc5、Cd44和Lyve1）以及細(xì)胞增殖（Mki67）相關(guān)的標(biāo)記物表達(dá)增加。
為了進(jìn)一步確定膽固醇在NASH驅(qū)動(dòng)HCC中的作用，本研究采用Ezetimibe（EZE）進(jìn)行干預(yù)，EZE可阻止腸道吸收膽固醇，盡管其在臨床NASH中的作用尚不明確，但其在DEN+HFHC驅(qū)動(dòng)的HCC中干預(yù)效果已被證實(shí)。EZE干預(yù)DEN+HFHC小鼠模型后，肝臟膽固醇、相關(guān)基因表達(dá)水平（Hmgcr 和 Hmgcs1）、肝纖維化程度等等均得到改善。由此進(jìn)一步說明，膳食膽固醇可以促進(jìn)NASH驅(qū)動(dòng)HCC的發(fā)展。
圖 2. HFHC喂養(yǎng)促進(jìn)DEN處理的野生型小鼠NASH驅(qū)動(dòng)的HCC發(fā)展
肝細(xì)胞STARD1 缺失可減弱NASH驅(qū)動(dòng)的HCC
為了探討STARD1在NASH驅(qū)動(dòng)HCC中的作用，本研究構(gòu)建了肝臟特異Stard1敲除小鼠(Stard1△Hep)評(píng)價(jià)NASH驅(qū)動(dòng)HCC的易感性。MUP-uPA小鼠肝細(xì)胞中STARD1缺失，該動(dòng)物是一種內(nèi)源性慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，其特征是尿激酶纖溶酶原激活劑（uPA）表達(dá)，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和過度喂養(yǎng)協(xié)同作用發(fā)展為肝癌。將MUP-uPA小鼠與Stard1△Hep小鼠雜交繁育MUP-uPA-Stard1△Hep小鼠并采用HFHC飲食。與MUP-uPA-Stard1f/f小鼠相比，MUP-uPA-Stard1△Hep小鼠表現(xiàn)出肝臟Stard1表達(dá)顯著降低。HFHC飲食喂養(yǎng)MUP-uPA-Stard1f/f小鼠26周會(huì)導(dǎo)致肝臟腫瘤發(fā)展，但MUP-uPA-Stard1△Hep小鼠腫瘤數(shù)量和最大面積顯著減少。同時(shí)血清Afp水平降低和參與纖維化（Col1a1和Acta2）和炎癥（Il6和Il1b）的基因表達(dá)降低，以及腫瘤標(biāo)記物（Afp、Cd44和Ly6d）水平降低。有趣的是， Stard1敲除并不影響MUP-uPA-STARD1△Hep小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物的表達(dá)，表明在NASH驅(qū)動(dòng)的HCC模型中，Stard1缺失的抑癌作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無關(guān)。
圖3. MUP-uPA小鼠肝細(xì)胞Stard1缺失減弱了小鼠中NASH驅(qū)動(dòng)的HCC
此外，對(duì)Stard1△Hep小鼠進(jìn)行DEN干預(yù)，然后進(jìn)行HFHC飲食24周。與MUP-uPA模型相似，DEN處理的Stard1△Hep小鼠對(duì)HFHC介導(dǎo)的HCC發(fā)展具有相對(duì)抵抗力，表現(xiàn)出腫瘤多樣性和最大面積的降低、血清Afp水平降低。Stard1△Hep小鼠腫瘤Yap和Afp表達(dá)降低和腫瘤標(biāo)記物mRNA水平降低，而炎癥相關(guān)基因沒有變化。在DEN+HFHC處理的Stard1△Hep小鼠中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物表達(dá)不變。因此，這些結(jié)果說明STARD1在NASH驅(qū)動(dòng)HCC中獨(dú)立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵作用。
圖 4. Stard1△Hep小鼠對(duì)DEN+HFHC誘導(dǎo)的HCC不太敏感
STARD1過表達(dá)加劇DEN+HFHC飲食驅(qū)動(dòng)的 HCC
為了進(jìn)一步確證STARD1在NASH驅(qū)動(dòng)HCC中的作用，在DEN+HFHC野生小鼠處死前5周注射攜帶Stard1 cDNA腺病毒來過表達(dá)Stard1（AD-Stard1）。與注射空白對(duì)照載體小鼠（AD-對(duì)照）相比，AD-Stard1組肝臟Stard1表達(dá)（mRNA和蛋白水平）增加15倍。這一結(jié)果增強(qiáng)了DEN+HFHC肝臟腫瘤多樣性。在AD-Stard1組中，HCC標(biāo)志物（Afp、Yap）在腫瘤中的表達(dá)程度更高。此外，腫瘤標(biāo)志物（Afp、Yap、Golm1 或 Krt19）表達(dá)、炎癥相關(guān)和缺氧調(diào)節(jié)基因表達(dá)增強(qiáng)。AD-Stard1肝臟氧化應(yīng)激顯著高于AD-對(duì)照組。STARD1促腫瘤作用需要飲食中添加膽固醇（HC），在DEN+常規(guī)飲食喂養(yǎng)的小鼠或單獨(dú)喂養(yǎng)HC 24周的小鼠中，STARD1過表達(dá)不會(huì)導(dǎo)致HCC發(fā)生。總的來說，STARD1和膳食膽固醇協(xié)同促進(jìn)HCC發(fā)展。
圖5. Stard1過表達(dá)增加DEN+HFHC驅(qū)動(dòng)的HCC
STARD1調(diào)節(jié)BA水平
鑒于BAs與NASH進(jìn)展和HCC發(fā)展有關(guān)，本研究對(duì)STARD1是否調(diào)節(jié)NASH驅(qū)動(dòng)HCC中肝臟BAs水平進(jìn)行研究。對(duì)AD-Stard1和Stard1△Hep小鼠肝臟BAs進(jìn)行質(zhì)譜分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與AD對(duì)照組小鼠相比，AD-Stard1小鼠肝臟中BA總含量增加，如βMCA和CA及其牛磺結(jié)合衍生物Tα/βMCA和TCA水平增加，其水平比去氧膽酸（TUDCA）、牛磺去氧膽酸（TCDCA））高1個(gè)數(shù)量級(jí)。與Stard1f/fmice相比，Stard1△Hep小鼠總肝BA水平顯著降低，TCA、bMCA和CA水平較低。與MUP-uPA-Stardf/f小鼠相比，在MUP-uPA-Stard1△Hep小鼠中觀察到類似的βMCA、Tα/βMCs和TCA水平降低。但在AD-Stard1或Stard1△Hep小鼠中，替代途徑中BA合成的中間產(chǎn)物氧化甾醇24S-羥基膽固醇（24S-OH-Chol）和27-羥基膽固醇（27-OH-Chol）水平?jīng)]有變化。有趣的是，AD-Stard1小鼠 Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1和Cyp7b1以及STARD1△Hep小鼠Cyp27a1和Cyp7a1的表達(dá)保持不變。此外，Stard1過表達(dá)的AD-Stard1小鼠中FXR (Nr1h4)以及Nr0b2和Abcd11表達(dá)降低（50-60%），但Nr1h4及其靶基因 Nr0b2、Abcb11和Abcb4在DEN+HFHC Stard1△Hep小鼠與 DEN+HFHC Stard1f/f小鼠中無差異，表明Stard1在BA合成和HCC發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用與FXR無關(guān)。這些結(jié)果表明，HCC發(fā)展過程中肝BAs中很大一部分受STARD1調(diào)控。
BAs誘導(dǎo)參與自我更新、干性和炎癥基因的表達(dá)
為探討STARD1介導(dǎo)的BAs調(diào)控與HCC之間的關(guān)系，本研究檢測(cè)了STARD1調(diào)控BAs對(duì)參與自我更新和多能性的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響，這些轉(zhuǎn)錄因子與HCC發(fā)病機(jī)制有關(guān)。TIC (CD133+/CD49f+)從 HCC小鼠模型分離出來，并顯示出具有致癌活性和致瘤性。用CA、TCA和βMCA聯(lián)合治療TICs，其濃度模擬AD-Stard1小鼠中觀察到的水平，結(jié)果顯示膽汁酸增加Yamanaka轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Pouf51、干細(xì)胞標(biāo)記物Nanog和Cd24、炎癥因子Ccl2和Cxcl1的表達(dá)。有趣的是，成熟肝臟中多能干細(xì)胞和早期分化基因的表達(dá)水平與胎肝和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞相似。與先前研究結(jié)果一致，原代小鼠肝細(xì)胞（PMH）與CA、TCA和βMCA孵育Sox2、Myc、Klf4和Pouf51表達(dá)、干細(xì)胞相關(guān)和癌癥干細(xì)胞標(biāo)記物Cd24、Cd44、Sox9和Nanog以及炎癥基因Ccl2和Cxcl2的表達(dá)顯著增加。盡管CDCA和次級(jí)BAs（DCA和LCA）對(duì)TIC具有細(xì)胞毒性，但較低濃度（10 uM）BAs可誘導(dǎo)參與自我更新、干細(xì)胞和炎癥的基因表達(dá)。
圖6. NASH-HCC模型中BAs的分子種類及其對(duì)自我更新、干性和炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響
小結(jié)
NASH驅(qū)動(dòng)HCC發(fā)展是一個(gè)日益增長的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，且發(fā)病率將進(jìn)一步增加（與肥胖、糖尿病有關(guān)），由于對(duì)HCC發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不足，其有效治療受到限制。本研究揭示NASH驅(qū)使HCC的新機(jī)制，闡明了類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白1（STARD1）在NASH驅(qū)動(dòng)HCC中的關(guān)鍵作用，STARD1通過調(diào)控線粒體替代途徑中BAs的生成，刺激肝細(xì)胞多能性、自我更新以及炎癥進(jìn)而促進(jìn)NASH驅(qū)動(dòng)HCC發(fā)生發(fā)展。本研究為肝癌的預(yù)防和治療提供了一定理論基礎(chǔ)和潛在靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)
Laura Conde de la Rosa, et al. STARD1 promotes NASH-driven HCC by sustaining the generation of bile acids through the alternative mitochondrial pathway. Journal of Hepatology.2021.https://doi.org/10.1016/j.jhep.2021.01.028.
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