通常來說，開發(fā)一種新型疫苗需要經(jīng)過數(shù)年的艱苦過程，包括完整的生產(chǎn)工藝確定。這樣的模式?jīng)]辦法對一些爆發(fā)性的傳染疾病做出快速響應(yīng)，而且面對一些商業(yè)潛力比較小的區(qū)域性疾病或者是某些定制化疫苗也是力有不逮。
在病毒載體家族里面，腺病毒的應(yīng)用非常廣泛，它具有誘導(dǎo)抗體和T細(xì)胞組合反應(yīng)的潛能。雖然人群中廣泛存在的先天免疫可能會使人源腺病毒疫苗載體的效果大打折扣，但是如果采用靈長類動物來源的腺病毒或者人源稀有型腺病毒就可以克服這一障礙，保證安全的同時免疫原性也大大提升，采用腺病毒平臺的埃博拉疫苗已經(jīng)在中國上市，而且很多項目處于臨床階段和臨床前，針對的疾病包括瘧疾、中東呼吸綜合癥(MERS)、呼吸道合胞病毒和多種癌癥。
腺病毒(Adenovirus)
是一種沒有包膜的直徑為70～90nm的顆粒，由252個殼粒呈廿面體排列構(gòu)成。
圖片來源:https://www.innovationtoronto.com
雖然非復(fù)制性腺病毒載體(Ad)的GMP級別生產(chǎn)方法并不少見，但是依然存在很多挑戰(zhàn)。面臨突發(fā)疫情，如何快速為臨床前實驗生產(chǎn)匹配GMP要求的腺病毒疫苗變的尤為重要，該工藝需要具有可放大性、簡潔性，盡可能采用一次性技術(shù)，能夠很快的進(jìn)行生產(chǎn)場地轉(zhuǎn)移與調(diào)整。
最近，默克技術(shù)團(tuán)隊聯(lián)合牛津大學(xué)Jenner研究所對基于靈長類來源的三種腺病毒載體疫苗(ChAdOx2，針對狂犬病；ChAd63，針對瘧疾；ChAdOx1，針對裂谷熱)的工藝開發(fā)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明：該方案具有非常好的平臺性，少許改動便可以在不同的腺病毒血清型疫苗中進(jìn)行切換，面對突發(fā)疫情可以在短時間內(nèi)完成臨床前樣品工藝開發(fā)工作1。
特地摘錄，以饗讀者
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一、上游技術(shù)
1、細(xì)胞株與發(fā)酵罐
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懸浮培養(yǎng)HEK293 T-rex細(xì)胞，并逐漸降低FBS濃度至0.5%，接種于Mobius?發(fā)酵罐中，接種密度為1.5-2.0*106 cells/mL，DO設(shè)定為50%空氣飽和度，pH設(shè)置為7.2-7.3 (CO2或7.5%碳酸氫鈉)，采用MOI (感染復(fù)數(shù))為3進(jìn)行病毒接種，3小時后，加入1.5倍體積新鮮培養(yǎng)基。
2、細(xì)胞裂解、核酸酶消化以及澄清
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病毒感染42h后，加入1/9發(fā)酵液體積的裂解緩沖液(10% v/v聚山梨醇酯 20，50%w/v蔗糖，20mM MgCl2，500mM Tris pH8.0，Benzonase? 60 units/mL)，關(guān)閉DO與pH控制，保持?jǐn)嚢瑁?/span>37℃。2h后，采用Millistak+? HC Pro C0SP深層濾器進(jìn)行澄清處理，通量為6.6 L/min/m2。使用之前采用1% v/v聚山梨醇酯20，5%w/v 蔗糖，2 mM MgCl2，50mM Tris pH8.0緩沖液進(jìn)行濾器潤洗及排氣。
二、下游技術(shù)
1、濃縮與透析
澄清完成后采用Pellicon? 2 BioMax 300KD (C篩網(wǎng))TFF進(jìn)行切向流濃縮換液，為下游純化做準(zhǔn)備，通量為6 L/min/m2。完成6-10濃縮后換到層析平衡液: 100 mM NaCl、1 mM MgCl2、0.1% v/v聚山梨醇酯20、5% w/v蔗糖、50mM bis-tris、pH6.5。
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2、層析
篩選了三種膜層析介質(zhì)，包括Natrix? Q膜層析，采用過量上樣純化后的腺病毒載體的方式測定動態(tài)結(jié)合載量，用A280進(jìn)行判定。步驟為：上樣后清洗10個膜體積，然后1M NaCl、1mM MgCl2、 0.1% v/v 聚山梨醇酯20、 5% w/v 蔗糖、 50mM Tris-HCl、 pH 8.0。
3、濃縮換液與除菌過濾?
層析結(jié)束后，采用和3一樣的TFF濾器進(jìn)行第二次濃縮換液，通量為0.83 L/min/m2，交換至A438緩沖液中(10mM 組氨酸、7.5%蔗糖、35mM NaCl、1mM MgCl2、0.1% PS-80、0.1mM EDTA、0.5%v/v乙醇 pH6.6、跨膜壓為0.5bar)。最后采用0.2um濾器Millipak?-20進(jìn)行除菌過濾。
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4、下游收率
小? 結(jié)
簡而言之，該方案上游采用了Mobius?一次性生物反應(yīng)器技術(shù)，具有放大性好，無需驗證的特點。下游采用默克全新的Millistak? C0SP深層過濾膜包進(jìn)行料液澄清，Pellicon? 2 BioMax 300 KD TFF (C篩網(wǎng))膜包進(jìn)行濃縮換液。下游層析步驟篩選了Natrix? Q膜層析介質(zhì)，具有高流速，高載量的特點，尤其是um級的開孔，比傳統(tǒng)柱層析更有利用病毒類顆粒的結(jié)合，同時也無需驗證，既用既拋。最后同樣采用Pellicon? 2 BioMax 300 KD TFF (C篩網(wǎng))進(jìn)行濃縮以及制劑緩沖液置換，最后采用0.2um濾器Millipak?-20進(jìn)行除菌過濾。
整套方案流程簡潔、可操作性強、平臺性好，可以借鑒在多種腺病毒載體疫苗或腺病毒轉(zhuǎn)基因載體工藝開發(fā)，快速應(yīng)對突發(fā)疫情。
如您需要了解默克純化產(chǎn)品，請點擊此處。
注釋及參考文獻(xiàn)：
1．Sofiya Fedosyuk , Thomas Merritt, et, Vaccine, 2019
Nov 8;37(47):6951-6961
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