急性腎損傷(AKI)是一種病因廣泛，破壞性強(qiáng)，以腎功能急劇下降為特征的臨床綜合征，約10%-15%的住院患者及超過半數(shù)的重癥患者會(huì)受該疾病影響。隨著發(fā)病率的不斷攀升，AKI的早期診斷至關(guān)重要，能確保盡早干預(yù)或減輕不斷發(fā)展的腎臟損害。在過去，AKI的診斷主要基于血清肌酐的檢測，但對大多數(shù)種類的AKI而言，腎小球?yàn)V過率降低和肌酐水平升高已屬晚期且不敏感的指標(biāo)。因此，僅依賴血清肌酐水平可能會(huì)導(dǎo)致AKI診療延誤從而導(dǎo)致不良結(jié)果。
近年來，新型急性腎損傷生物標(biāo)志物IGFBP7已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床不同類型AKI的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測。IGFBP7是胰島素生長因子家族成員之一，不同于家族中其它蛋白1-6，對IGF的結(jié)合親和性較低。與此同時(shí)，IGFBP7更是一種存在于AKI患者體循環(huán)中的分泌蛋白，人們尚不清楚它是否在AKI進(jìn)展中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。本研究的結(jié)果可能提高我們對IGFBP7在腎損傷中的作用的理解，并為AKI患者開發(fā)新的治療方法提供信息。
2022年6月，安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院孟曉明教授研究團(tuán)隊(duì)在國際期刊《腎臟國際 (Kidney International) 》上發(fā)表了題為《胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7通過減輕多聚ADP核糖聚合酶1的降解促進(jìn)急性腎損傷 (Insulin-like growth factor binding protein 7 promotes acute kidney injury by alleviating poly ADP ribose polymerase 1 degradation) 》的研究論文。該研究論文分析了AKI患者、各類動(dòng)物模型中血清、尿液以及腎臟中IGFBP7的表達(dá)變化和定位，通過構(gòu)建IGFBP7全身性敲除、腎臟條件性敲除小鼠及基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IGFBP7促進(jìn)腎臟炎癥和程序性死亡的新功能，并通過質(zhì)譜找到了與IGFBP7相互作用的關(guān)鍵靶蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1（PARP1），并且通過拮抗泛素化E3連接酶環(huán)指蛋白4（RNF4），抑制PARP1泛素化降解，促進(jìn)AKI的發(fā)生發(fā)展。該研究加深了人們對IGFBP7在腎臟損傷和炎癥中功能和機(jī)制的認(rèn)識，也為早期預(yù)防和治療AKI提供了新的思路。
研究方法與結(jié)果
1.急性腎損傷中，人腎活檢、小鼠模型和TECs模型中IGFBP7表達(dá)增加
IHC顯示AKI患者組織中IGFBP7水平明顯升高，患者血清及尿液樣本中IGFBP7也同樣如此。血清IGFBP7水平與肌酐水平呈正相關(guān)。熒光染色表明順鉑或缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷小鼠中IGFBP7水平同樣明顯升高，且IGFBP7定位于腎小管上皮。兩種小鼠模型中血清和尿液IGFBP7水平均升高，且IGFBP7在mRNA和蛋白水平均持續(xù)上調(diào)。體外研究同樣證實(shí)了經(jīng)順鉑和缺氧復(fù)氧(H/R)刺激后誘導(dǎo)了IGFBP7產(chǎn)生。與此同時(shí)，結(jié)果顯示順鉑誘導(dǎo)c-Jun的表達(dá)具有時(shí)間依賴性，過表達(dá)c-Jun后顯著上調(diào)了順鉑誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞IGFBP7蛋白水平。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，順鉑刺激增強(qiáng)了c-Jun與IGFBP7啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合。
2. IGFBP7的減少可預(yù)防順鉑、缺血再灌注及脂多糖誘導(dǎo)的腎功能障礙、損傷和炎癥
PCR、Western blot和IHC表明IGFBP7全身性敲除小鼠構(gòu)建成功。PAS染色顯示敲除IGFBP7可以減輕順鉑等因素誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷。BUN和血清CRE水平反映了腎臟損傷的嚴(yán)重程度，同樣證實(shí)了上述結(jié)果。IGFBP7敲除后KIM-1蛋白表達(dá)明顯降低，IHC染色、Western blotting、real-time PCR和TUNEL染色顯示，IGFBP7敲除后KIM-1水平降低，炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少，減弱了p65NF-kB的激活及AKI小鼠模型中的細(xì)胞程序性死亡。
3. 條件性敲除IGFBP7可減輕順鉑誘導(dǎo)的腎功能障礙、損傷和炎癥
ELISA結(jié)果表明條件性敲除IGFBP7的可降低順鉑誘導(dǎo)的AKI模型血、尿中IGFBP7的水平。故在AKI模型中，腎小管上皮細(xì)胞可能是IGFBP7產(chǎn)生的最重要來源。電鏡觀察顯示順鉑誘導(dǎo)的IGFBP7 FF組出現(xiàn)質(zhì)膜破裂、細(xì)胞器腫脹、細(xì)胞器內(nèi)容物丟失等病理現(xiàn)象，但在IGFBP7 cKO組得以緩解。同時(shí)，IGFBP7 cKO組中KIM-1、炎癥細(xì)胞因子和程序性細(xì)胞死亡水平也下調(diào)了。
4. 恢復(fù)全敲小鼠中IGFBP7后，順鉑誘導(dǎo)的腎損傷和炎癥加重
為了進(jìn)一步闡明IGFBP7的關(guān)鍵功能，使用IGFBP7過表達(dá)腺相關(guān)病毒恢復(fù)了敲除小鼠中的IGFBP7的表達(dá)?；謴?fù)IGFBP7表達(dá)后增加了BUN、血清CRE水平和腎臟損傷，IHC和Western blotting顯示恢復(fù)后誘導(dǎo)了KIM-1和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并激活p65 NF-kB通路和程序性細(xì)胞死亡。
5. IGFBP7與PARP1的BRCT結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并通過拮抗E3連接酶RNF4抑制PARP1的泛素化
LC-MS/MS結(jié)果表明順鉑誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞中IGFBP7和PARP1結(jié)合評分顯著升高。Co-IP結(jié)果證實(shí)IGFBP7與順鉑刺激的HK2細(xì)胞中PARP1結(jié)合增強(qiáng)，IGFBP7或PARP1過表達(dá)后也增強(qiáng)。此外，Co-IP研究了IGFBP7與全長PARP1或各種截?cái)嗤蛔凅w之間的相互作用。結(jié)果表明，IGFBP7主要與PARP1的BRCT結(jié)構(gòu)域相互作用。并且IGFBP7通過抑制蛋白酶介導(dǎo)的PARP1降解來增加PARP1的表達(dá)。
Co-IP結(jié)果確定IGFBP7上調(diào)后， PARP1泛素化水平降低。UbiBrowser預(yù)測了PARP1的泛素化區(qū)域，結(jié)果顯示泛素E3連接酶RNF4和IGFBP7與PARP1結(jié)合區(qū)域有大量重疊。特異性泛素E3連接酶RNF4可以靶向類泛素化修飾PARP-1，隨后被泛素蛋白酶體系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記降解。IGFBP7上調(diào)顯著降低了PARP1和RNF4之間的相互作用強(qiáng)度。結(jié)果表明IGFBP7通過拮抗E3連接酶RNF4抑制PARP1的泛素化。
結(jié) 論
總之，結(jié)果表明在各種因素誘導(dǎo)的AKI中，IGFBP7在TECs中高度表達(dá)，其通過c-jun依賴機(jī)制表達(dá)升高，同時(shí)通過拮抗E3連接酶RNF4增加PARP1的表達(dá)，在體內(nèi)和體外均可加重腎臟炎癥和損傷。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了新型生物標(biāo)志物IGFBP7信號通路在多個(gè)水平上的藥理靶向作用，如抑制IGFBP7/PARP1軸，可能代表未來新的AKI治療策略等。
吉?jiǎng)P助力
本文IGFBP7, PARP1和RNF4沉默質(zhì)粒、IGFBP7過表達(dá)病毒均由吉?jiǎng)P基因提供，助力高水平科學(xué)研究。
作者簡介
安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院孟曉明教授和安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科王偉副教授為該論文的并列通訊作者，藥學(xué)院博士研究生庾聚濤為第一作者。
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