2021年12月14日，農業農村部發布了關于印發《“十四五”全國畜牧獸醫行業發展規劃》的通知并指出，“繼續開展非洲豬瘟包村包場排查和入場采樣監測”。
2022年1月17日，中國動物疫病預防控制中心印發的《非洲豬瘟防控技術指南》中指出“屠宰企業要嚴格落實非洲豬瘟自檢制度，防止陽性豬只產品流入市場環節”。
近岸蛋白響應國家政策和市場需求，自主研發生產ASFV p72活性蛋白復合物、p30蛋白、p54蛋白、pS273R蛋白、qPCR、LAMP等酶及試劑，且性能優質，滿足市場需求，數據詳見下文信息。
據世界動物衛生組織（World Organisation for Animal Health，OIE）報告，2020年1月以來，已在35個國家檢測到ASFV，影響了超過100萬頭豬和3萬頭野豬（數據來源INs和FURs報告），動物損失超過170萬頭。從下圖中可以看到，在中國多個省市均有發現ASFV疫情，整體是比較嚴重的。
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為了滿足國內日益增長的非洲豬瘟監測需求，農業農村部自2019年以來一共批準了7種非洲豬瘟檢測試劑新獸藥。
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據國家統計局公布的數據，2021年全國生豬出欄量達6.7億頭。由此可見，ASFV監測的需求是非常龐大的。2021年7月2日，中國動物疫病預防控制中心公布了通過專家評審的ASFV抗體檢測試劑盒名單，具體情況見下表：
背景介紹：
非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家豬或野豬引起的一種急性、熱性、高度傳染性疾病。ASF原發于非洲，蜱（軟蜱科中的鈍緣蜱屬）是其自然宿主和傳播媒介，該病病程短、死亡率高，OIE將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。
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ASFV具有獨特而復雜的五層結構，從外到內分別是外膜（Outer membrane）、衣殼（Capsid）、內膜（Inner membrane）、核殼（Core shell）以及核心（Nucleoid）。
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ASFV病毒結構示意圖（Sheng Liu, et al. Cell Host&Microbo，26, 836–843）
從整體上看，ASFV衣殼結構跟其他核質大DNA病毒（nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDVs）衣殼結構較為相似，由20個三重對稱殼粒聚集體（Trisymmetron）和12個五重對稱殼粒聚集體（Pentasymmetron）組成。其中，每個Trisymmetron由135個殼粒（Capsomer）組成，而每個Pentasymmetron由30個殼粒和1個五鄰體（Penton）組成。而常用于檢測的p72蛋白（近岸蛋白可提供ASFV p72活性蛋白復合物）就是殼粒的主要組成蛋白之一。其基因組為雙鏈閉合線性DNA分子，基因組大小為170～194 kbp，含有150～167 個開放閱讀框（open reading frames，ORF），編碼54 種結構蛋白和100 多種非結構蛋白。而常用于核酸檢測靶基因為B646L(近岸蛋白可提供qPCR、LAMP等相關酶及試劑），此區域也作為ASFV基因分型區域。
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ASFV病毒主要蛋白（圖片來自于網絡）
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病毒復制及感染癥狀:
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ASFV 通過內吞或者胞飲作用侵染宿主細胞，其靶細胞主要是單核-巨噬細胞。利用巨胞飲泡或內吞體中低pH的環境，病毒顆粒脫去病毒囊膜，病毒內膜與內體膜融合，暴露病毒基因組。病毒DNA復制與病毒顆粒的組裝發生在稱為“病毒工廠”-靠近細胞核的特殊胞質區。隨后病毒在細胞內組裝成成熟的二十面體病毒顆粒，并在細胞中進行復制、轉錄和翻譯。基因組和蛋白質組裝完成后通過動力蛋白運輸到細胞膜附近，經出芽釋放到細胞外。
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根據GB/T 18648-2020，將該病毒的臨床表現分為最急性、急性、亞急性和慢性。具體表現如下：
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（一）最急性：無明顯臨床癥狀突然死亡。
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（二）急性：體溫可高達42攝氏度，沉郁，厭食，耳、四肢、腹部皮膚有出血點，可視黏膜潮紅、發紺。眼、鼻有黏液膿性分泌物；嘔吐；便秘，糞便表面有血液和黏液覆蓋；腹瀉，糞便帶血。共濟失調或步態僵直，呼吸困難，病程延長則出現癱瘓、抽搐等其他神經癥狀。妊娠母豬流產。病死率可達100% 。病程4至10天。
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（三）亞急性：癥狀與急性相同，但病情較輕，病死率較低。體溫波動無規律，一般高于40.5攝氏度。仔豬病死率較高。病程5至30天。
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（四）慢性：波狀熱，呼吸困難，濕*。消瘦或發育遲緩，體弱，毛色暗淡。關節腫脹，皮膚潰瘍。死亡率低。病程2至15個月。
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疫苗研發:
迄今為止ASFV疫苗研發進展緩慢，ASFV的復雜性是疫苗研制延遲的一個主要因素。滅活疫苗迄今尚未成功，可能是因為病毒顆粒有兩種感染形式，即細胞外和細胞內成熟，而中和抗體不能完全抑制這些不同病毒的感染。病毒蛋白p72、p54和p30是已知的中和抗體靶點。減毒活疫苗可誘導高達100%的免疫保護,但是其安全性是個問題，此類疫苗上市仍需要數年時間。基于單個或多個基因或蛋白制作的ASFV亞單位疫苗可能比減毒活疫苗更安全。
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抗病毒藥: ?
ASFV具有許多復制所需的特異性酶類，包括RNA和DNA聚合酶，這些酶應該是抗病毒藥物開發的良好特異靶點。有幾種化合物已被證明在細胞培養中抑制了ASFV的復制，但到目前為止還沒有在豬身上進行過試驗，目前暫無上市藥物。
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因為缺乏疫苗以及特別藥，目前控制ASF必須依賴于檢疫和屠宰政策以及快速檢測。這也是國家和各省市接連出臺相關防控政策的重要原因。
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常見檢測方法:
根據GB/T 18648-2020，目前該病毒檢測主要分為核酸檢測、抗體檢測、抗原檢測三大類。
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抗體檢測：是指用抗原檢測感染樣本中ASFV抗體的方法。ASFV抗體在感染早期（7-10天）就可被檢測到，并且會存在數年甚至終生。而ASFV抗體陽性，是機體感染該病毒的最直接證據。GB/T 18648-2020中詳細的介紹了ELISA間接、阻斷（競爭）、夾心等方法的步驟及結果判讀。該方法適用于亞急性、慢性、及大規模血清篩查，但不適用于急性病例（因檢測到抗體時，豬可能已經死亡）。目前，用于抗體檢測的抗原主要包括p30、p54、p72等蛋白（近岸蛋白可提供非洲豬瘟抗體檢測所需p72、p30、p54抗原產品）。如INGENASA基于p72特異性抗體的阻斷ELISA檢測試劑盒，SVANOVIR 基于p30蛋白的間接ELISA檢測試劑盒等。
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近岸蛋白提供真核細胞表達的ASFV p72活性蛋白復合物，純度大于95%，靈敏度高，已經大規模生產，客戶認可度高。該蛋白經ELISA方法驗證，具有較高的靈敏度，優于競爭公司。
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通過檢測ASFV陰性及陽性樣本及其他疾病樣本，顯示近岸蛋白ASFV p72蛋白陰陽性符合率高，且特異性好，優于競爭公司。
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近岸蛋白相關產品
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DRA149 |
Recombinant ASFV p30 |
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核酸檢測：是指使用核酸擴增法檢測感染樣本中ASFV目標基因的方法。已獲批的核酸檢測試劑盒，主要采用qPCR法和熒光恒溫擴增法兩種（近岸蛋白可提供qPCR、LAMP等相關酶及試劑）。目前，qPCR檢測是該病毒檢測的“金標準”，其靈敏度及特異性好，并且設計了防污染系統避免了假陽性問題。qPCR法大多基于ASFV B646L基因的高度保守區設計。也有根據E183L基因、CP530R 基因、CSFV 5'UTR 基因和HP-PRRSV NSP2 基因設計引物和探針。qPCR法檢測的靈敏度可比普通PCR法高10~1000倍，已廣泛應于ASFV的檢測，可以在1h內完成檢測。也有部分試劑盒不用核酸提取，直接擴增，但對樣品類型要求較高，敏感性也受影響。目前由國家出臺的GB/T 18648-2020中所描述的非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法在我國非洲豬瘟病毒檢測中發揮重要作用。
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近岸蛋白提供高靈敏度、高穩定性qPCR檢測酶及試劑，適用于不同核酸提取方式獲取的樣本檢測，并具備超強防污染性能，有效防止假陽性。
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近岸蛋白相關產品
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貨號 |
產品名稱 |
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同時，為進一步提高ASFV檢測效率，越來越多的試劑盒開發商傾向于核酸免提取方式，一方面進一步壓縮檢測時間，另一方面減少核酸提取成本。為滿足該部分應用，近岸蛋白特開發血液直擴型qPCR檢測試劑，經ASFV核酸檢測驗證，可耐受整個檢測體系中20-30%的全血含量，抗抑制性能強，并可進行四重基因擴增。
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近岸蛋白相關產品
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貨號 |
產品名稱 |
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E179 |
NovoStart? Blood Direct Probe qPCR SuperMix(UDG) |
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雖然qPCR方法檢測靈敏度高，但受限于儀器設備和實驗條件，不能做到實地檢測，對于大多數檢測條件有限的養殖戶來說成本較高。LAMP等溫擴增法解決了該類限制，為基層實驗室提供了一種選擇。LAMP利用Bst DNA聚合酶，在恒溫水浴鍋等簡易設備中即可完成檢測，并可用肉眼觀測結果。LAMP優勢是快速、靈敏，可以在30min內完成檢測，操作簡單，不需要特殊的儀器設備，在基層如屠宰場、養殖場具備廣闊的應用前景。
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近岸蛋白提供基于BST 2.0 DNA聚合酶設計的核酸檢測試劑，靈敏度高，搭配逆轉錄酶可進行RNA樣本的檢測。
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近岸蛋白相關產品
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貨號 |
產品名稱 |
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E020-01A |
BST 2.0 DNA Polymerase |
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抗原檢測：是指采用抗體檢測ASFV抗原的方法。ASFV抗原檢測目前最常用的方法是夾心ELISA抗原檢測。ASFV的p30蛋白由CP204L基因編碼，具有很強的免疫原性，可誘導機體產生中和抗體，為病毒的早期蛋白，在感染后4h胞漿內即可檢測到。GB/T 18648-2020中詳細描述了采用p30蛋白單克隆抗體檢測相應的抗原。雖然該方法靈敏度低于“金標準”，存在假陰性的缺陷，但是因為其成本比PCR更為低廉且可在沒有特殊實驗室儀器的設備下操作，可作為急性病例或者大規模的樣本篩查輔助方法。基于抗體開發的膠體金免疫層析法，操作簡單、快速，可以10min內完成檢測，不需要儀器讀數。但該方法的靈敏度較差，可能會存在假陰性結果。由于其局限性，當前僅適用于病死豬的ASFV檢測。截止目前有研究以檢測p72蛋白建立膠體金法。同樣基于側向層析的熒光免疫技術，靈敏度比膠體金提高了約100倍，操作比ELISA更簡便。該方法內含有大量熒光報告分子，熒光信號強而穩定，不受溶劑的影響，具有極強的抗光漂白能力，采用手持式熒光儀讀取數值，人為因素影響小。
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當前，我國在非洲豬瘟防控方面取得了積極的成效，但是過往疫情已經在我國形成較大的污染面積，仍然有爆發疫情的可能。我們必須加強疫病監測和實驗室檢測，控制傳染源，切斷傳播途徑，保護易感動物等相關措施，才能更好地防控疫情。
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? 參考文獻： Sheng Liu, et al. Cryo-EM Structure of the African Swine Fever Virus [J]. Cell Host&Microbo，26, 836–843. 《中華人民共和國國家標準GB/T 18648-2020》.岳龍等.非洲豬瘟概況綜述[J]. 養殖與飼料, 2020 年第05 期.歐云文等.非洲豬瘟病毒結構蛋白在病毒感染過程中的作用[J]. |
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? ? ? ? ? 蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應用解決方案的高新技術企業，主營業務為靶點及細胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發、生產和銷售，并提供相關技術服務。公司定位為醫療健康與生命科學領域原料與技術解決方案的上游供應商，致力于為下游客戶提供及時、穩定、優質的產品及服務，助力全球生物醫藥企業和研究機構的技術與產品創新升級。
詳詢www.novoprotein.com.cn或致電400-600-0940。