系統性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是一種罕見的自身免疫病，特征性的表現為皮膚和內臟器官的纖維化以及微血管病變。目前，有研究發現遺傳易感性、環境因素（病毒感染、藥物、化學物質如硅等）、女性激素、細胞及體液免疫異常等因素在SSc發生發展中起重要作用。但其具體發病機制仍不明確，導致缺乏有效治療方法。
之前的研究表明SSc中多種類型的T細胞，包括Th2，Th17，Th1，Th22 CD8+ T細胞都能夠參與致病過程。然而，在SSc病變中T細胞亞群定量以及浸潤性T細胞的表型和T細胞在發病機制中的確切作用仍然缺乏信息。
來自美國哈佛大學Shiv Pillai團隊在知名期刊Journal of clinical investigation（IF=）發表文章，文中大量使用組織流式定量分析方法檢測一系列浸潤細胞。發現表達顆粒酶的CD8+ T細胞和CD4+細胞毒性T細胞是SSc病變中最顯著的T細胞,其通過靶向殺傷內皮細胞以及分泌IL1β等促炎因子導致組織重塑的過度活躍，從而引發血管病變和組織纖維化。
實驗部分
01
首先，作者對35位系統性硬化癥患者的皮膚進行CD3+ T細胞和CD19+ B細胞免疫熒光染色，通過 TissueGnostic 公司的TissueFAXS掃描系統對其進行拍攝，利用TissueQuest分析系統定量浸潤T細胞與B細胞的百分比，發現T細胞的浸潤要高于B細胞，之后作者將目光對準T細胞，利用TissueQuest分析系統對比每一位患者中CD4+與CD8+ T細胞的比例。
02
然后，對35名未經治療的患者的皮膚中的CD4+ T細胞亞群進行分析，包括細胞毒性T細胞CTL（CD4,GZMA,DAPI）,Th2細胞(CD4,GATA3,DAPI)和其他類T細胞。利用TissueQuest分析系統精準計算35位患者和對照組中上述三種T細胞亞群占T細胞的比例和具絕對的細胞數量，得出大部分系統性硬化癥患者中CD4+細胞毒性T細胞占比最高。
03
為了探討CD4+細胞毒性T細胞靶向作用的可能性，作者檢測患者組織中的的凋亡信號（cCasp-3,DapI），再次利用TissueQuest分析系統對35位患者和10位正常人皮膚組織中cCasp-3陽性比例進行對比，同時獲得凋亡細胞的絕對數量，得出無論是在比例上還是絕對數量上，系統性硬化癥患者中的凋亡都要強于正常人。
04
進一步的研究表明，系統性硬化癥患者中的凋亡主要來源于內皮細胞。在這一結果的證明中，作者使用多色染色標記分析CD4+細胞毒性T細胞（CD4,GZMA,cCasp-3）與內皮細胞（CD31）空間位置關系，發現浸潤性CD4+ CTL常常分布在內皮細胞周圍,其中一些內皮細胞正在發生凋亡，胞漿中可見GZMA，這表明內皮細胞可能代表CD4+ CTL定向的細胞毒性靶點。
文章的最后對CD4+ CTL進行了轉錄組的分析，從轉錄水平上分析與細胞毒性、代謝活性和組織重塑相關的基因的變化，并使用CTLA-Ig(能過阻斷T細胞活化)治療患者，4例患者中有3例組織浸潤的CD4+
CTL明顯下降，得出持續的T細胞活化似乎是早期彌漫性SSc的一個特征。
因此，針對CD4+ CTL可能是治療這類疾病的重要靶點。這篇文章使用了大量的免疫熒光染色及利用TissueQuest分析系統實現數據的精準定量分析，為文章的數據獲得提供了強有力的支持!