周細胞怎么分離？找遍了百度也沒有看到具體的protocol，不要急，看看我們技術整理的實踐經驗吧。
不用急，先把參考的文獻步驟截個圖
那么我們就進入正題吧
一.組織的處理
1.確保所有液體、容器、儀器和專用操作區域都是無菌的。
2.將組織樣本（由組織庫或手術團隊采購）放入由冷凍的基礎培養基的含20%胎牛血清（FBS）和2%青霉素-鏈霉素（P/S）冰上操作
3.從培養基中取出樣品，并用由磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）組成的洗滌介質洗滌，補充2%FBS和2%P/S。處理樣品時，使用細尖鑷子夾住大血管盡量減少對組織的擠壓。
4.將樣品浸泡在培養皿中的洗滌介質中，用消毒虹膜剪刀去除其他大血管和結締組織
5.使用單側剃須刀片或一把鋒利的虹膜剪刀將剩余的組織切成約1 mm3的小塊。
備注：如果立即處理樣品，將獲得最高的細胞產量。如果延遲是不可避免的，則將處理后的組織存儲在新鮮存儲介質（>5 ml/1 cm3組織）在4°C下持續72小時或者使用組織凍存液凍存一個月也能提取出來周細胞，但可能影響細胞產量。
二. 組織的消化和細胞的分離
1. 配制好消化溶液，使用DMEM配制各包含0.5mg/ml膠原酶I、膠原酶II和膠原酶IV，并在水浴中加熱至37°C。
2使用眼科剪刀剪碎組織，盡量剪碎
3.通過100µm的濾網過濾懸浮的組織塊，并用PBS洗滌兩次。將組織塊轉移到30 ml無菌容器中蓋子密封嚴密。
注意：短而寬的罐子比高而窄的管子效果更好。或者，將紙巾片裹在50毫升無菌試管外，石蠟封口后平置。
4.加入所有消化溶液（總計4.5 ml），并將容器放置在37°C、轉速設定為120 rpm的搖動水浴中的密封塑料袋中，或者，用石蠟膜密封容器，并將其放入設定為120rpm的加熱軌道振蕩器中。
5.15分鐘后，取出并倒置離心管三次，然后再震蕩15分鐘。吸出膠原酶，補充有5-10mlFBS和1%P/S。
6.用10毫升血清學移液管輕輕吹打10到20次，直至組織絮狀化后置于過濾懸架上依次通過100µm、70µm和最后40µm的細胞過濾器，以去除未消化的組織，獲得單細胞懸浮液。
注意：不要在細胞濾網之間沖洗，以免酶消化過程中產生細胞碎屑。
7.將細胞懸浮液以200 x g離心4分鐘，小心傾倒上清液，并將沉淀重新懸浮在1 ml紅細胞裂解緩沖液中在室溫下保持2分鐘，然后用4毫升PBS稀釋。
8.重復離心步驟，并將細胞重新懸浮在1mlPBS中。充分混合，取10µl細胞懸浮液進行細胞培養并計數。
9.將10µl細胞懸浮液與10µl臺盼藍染色劑混合，并將10µl混合物放在標準血細胞儀上進行細胞計數。
10.計算四個角落正方形（每個正方形細分為十六個小正方形）中明亮的圓形單元格的數量，除以4得到每個角平方的平均值。將平均值乘以2以說明染色稀釋因子，然后每1ml樣品乘以10^4便是獲得細胞總數。
二. 細胞培養：
準備好培養瓶，初代建議使用T25瓶培養，為了獲得更多的細胞 ，細胞鋪板前建議使用細胞包被液給培養瓶進行包被,（啟達生物：SD0044)培養箱包被15-20分鐘后，使用PBS沖洗兩次后待用
準備好周細胞專用培養基，此培養基包含周細胞生長因子和抑制成纖維和內皮細胞生長的小分子化合物 ，以促進周細胞生長更加純化，培養瓶加入2ml左右的PGM周細胞培養基（啟達生物:P4001)，
細胞離心后用周細胞培養基重懸，初次鋪板每個T25瓶不低于60萬以上的細胞量進行鋪板 ，48小時后換液 ，去除死細胞，
后期使用PGM培養基按照正常細胞操作換液或者傳代即可。
腦周細胞48h的生長圖
腦周細胞72h的生長圖
并不是所有的周細胞都使用這個操作方法哦 ，針對不同的周細胞，可能有更加優化的提取方法，來看看下面各組織的使用的方法吧，
一、 腦
可以使用酶消化和外植體培養從白質和灰質中分離腦周細胞（92107120-122）。它們表達PDGFRβ、αSMA、CD13、NG2、CD146和結蛋白（121）。可在PGM培養基中保持15-20倍增。
二、 心
使用酶消化、過濾和免疫磁分離從心房和心室中分離心臟周細胞，以獲得CD31–/CD34+細胞（21，32，55）。心臟周細胞可在PGM培養基中保持25倍增
三、骨骼肌
骨骼肌來源的周細胞主要通過外植體培養分離。不同的群體，如堿性磷酸酶/CD56–細胞和CD146+/NG2+/αSMA+/CD45–/CD31–/CD34–細胞，可以通過FACS或免疫磁性微珠純化（77，78，93123124）。此周細胞極容易脫落 ，建議使用toprocult基質膠(啟達生物：SD0058)稀釋25倍包被，包被后使用PGM可達15倍以上擴增
四、骨髓
骨髓周細胞可以使用微珠細胞分選策略進行免疫磁性分離。骨髓樣品用Ficoll Histopaque 1077處理以獲得單核細胞。首先，從CD45+/CD34+級分中陰性純化細胞群。然后，選擇CD146+細胞并進一步擴增，通過流式細胞術和免疫細胞化學最終確認CD45–/CD34–/CD146+組合的純度（105）。
五、腎
腎周細胞在調節通透性、肌成纖維細胞的形成、血管生成和腎髓質血流量方面至關重要（126-128）。在使用膠原酶混合物（IA、II和IV）進行組織消化后，對細胞進行FAC分選，以獲得CD146+/CD34–/CD45–/CD56–周細胞群，其也表達經典的制造商PDGFRβ和NG2。傳代時需使用細胞包被液（啟達生物：SD0044）上進行培養擴增。
六、 肺
分離人肺周細胞的方法包括酶消化、磁性微球分選和FACS選擇（109130-132）。然后，對細胞進行分選以收集CD45–/CD31–/CD326–/PDGFRβ+部分（109130）。此外，Kramann等人使用含有AY16（一種抗Trop2單克隆抗體）-DT3C綴合物的選擇培養基分離肺周細胞，以消除上皮干細胞和內皮細胞（131）。經修飾的培養基篩選的細胞表達PDGFRβ和硫酸軟骨素蛋白多糖4（CSPG4）。
七、皮膚
已經從新生兒包皮或成年女性乳房皮膚中分離出周細胞（133）。在用II型膠原酶或dispase消化后，通過FACS或免疫磁性微珠對VLA-1bri/CD45群體進行分類（112133135）。此外，皮膚周細胞表達人高分子量黑色素瘤相關抗原（HMW-MAA）、PDGFRβ、結蛋白、αSMA、α1β1-整合素、α-和γ-肌動蛋白亞型以及肌球蛋白（136）。
八、臍帶
人臍帶周細胞可以通過酶消化和外植體培養分離（31）。Helmbold等人使用CD146綴合的微珠對細胞進行免疫磁性分選，以分離CD146+群體（137）。Cathery等人通過外植體培養分離周細胞。對遷移的細胞進行免疫磁性分選，獲得CD31/NG2+群體（31）。所有分離的群體均表現出CD34的特征性陰性表達，CD146和NG2的陽性表達。使用PGM周細胞培養基，細胞可達20倍增以上。
九、 視網膜
從色素層分離后，通過酶解分離人視網膜周細胞。將細胞接種在明膠預涂層的培養皿上，并與含有FBS的DMEM/F-12一起培養。通過NG2、αSMA、神經膠質原纖維酸性蛋白和細胞骨架結構蛋白的免疫熒光染色來鑒定視網膜周細胞的特征形態.
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