隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，mRNA療法作為一種新興的治療手段，因其可編程性強、響應(yīng)速度快等優(yōu)勢備受關(guān)注。在mRNA疫苗和基因治療等領(lǐng)域中，高效合成高質(zhì)量的mRNA是實現(xiàn)療法目標(biāo)的關(guān)鍵步驟。而在這一過程中，T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）扮演著至關(guān)重要的角色，它能夠高效地催化體外合成mRNA的過程。
盡管T7 RNAP在mRNA合成中發(fā)揮著重要作用，但實際操作中經(jīng)常會產(chǎn)生double-stranded RNA（dsRNA）副產(chǎn)物。dsRNA是許多病毒的標(biāo)志之一，因此它容易被細胞內(nèi)的dsRNA結(jié)合蛋白識別，并觸發(fā)先天免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。這意味著，如果mRNA制劑中含有較高的dsRNA，可能會導(dǎo)致不必要的免疫激活，進而影響治療效果或引起副作用。過多的dsRNA也可能會干擾mRNA的正常功能，包括翻譯效率和mRNA的穩(wěn)定性，間接影響mRNA治療的效果。
圖1.dsRNA副產(chǎn)物的影響與優(yōu)化后的T7 RNAP反應(yīng)[1]
因此，開發(fā)和采用有效的方法來減少dsRNA的生成是mRNA技術(shù)發(fā)展中至關(guān)重要的一部分。研究者們已經(jīng)開發(fā)了多種策略，包括使用改良的T7 RNA 聚合酶，化學(xué)修飾核苷、調(diào)整 IVT 轉(zhuǎn)錄buffer，下游純化工藝等方法。翌圣生物利用其ZymeEditor定向進化平臺的能力，持續(xù)在進化mRNA體外合成的核心酶原料—T7 RNA聚合酶，開發(fā)出一款低dsRNA T7 RNA 聚合酶，抑制T7 RNA 聚合酶的RDRP活性，從根本上降低dsRNA的形成，從而可以大幅度降低dsRNA的含量。
產(chǎn)品數(shù)據(jù)
·
產(chǎn)量：穩(wěn)定在9mg/mL以上；
·
dsRNA含量：dsRNA的含量顯著降低了至少10倍以上；
·
片段加帽率高：均超過99%。
Low dsRNA T7 RNA Polymerase篩選過程 通過方法構(gòu)建隨機文庫&FADS高通量篩選方法，篩選超過10^6的隨機突變文庫。同時利用半理性設(shè)計&微孔板技術(shù)，篩選定點飽和文庫。兩種方法均獲得了低dsRNA T7 RNA 聚合酶突變體。在考慮dsRNA含量的同時，也考慮不降低其他指標(biāo)的前提下（如完整度/加帽率/產(chǎn)量等），選出一款突變體進行商品化應(yīng)用。
產(chǎn)品數(shù)據(jù) 01
在不同長度的應(yīng)用場景下，dsRNA無論跟WT T7 ，還是競品，在保證其他指標(biāo)不降的前提下，dsRNA 均有極顯著下降。
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片段長度 |
T7 RNA pol |
產(chǎn)量（mg/mL） |
完整度（%） |
dsRNA含量（(1ug RNA產(chǎn)生 ng的dsRNA) |
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4K |
T7-WT |
12.4 |
88.3 |
0.4273 |
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T7-低dsRNA |
12.1 |
89.9 |
0.0129 |
|
|
競品A |
11.0 |
87.8 |
0.0323 |
|
|
9K |
T7-WT |
9.5 |
81.9 |
2.9180 |
|
T7-低dsRNA |
9.0 |
82.0 |
0.0379 |
|
|
競品A |
7.2 |
78.7 |
0.1805 |
02
降低Cap analog的投入量，在不同的片段長度，以及與WT的對比下，投入量降低到2.5mM， 仍能得到優(yōu)異的加帽率。同時在細胞層面上，也能得到優(yōu)異的表現(xiàn)。
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Cap analog投入量（mM） |
加帽率（%）-4K |
1K |
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WT |
mutant |
WT |
|
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10 |
100 |
100 |
100 |
|
5 |
100 |
100 |
100 |
|
2.5 |
100 |
100 |
99.7 |
翌圣公開的文章《FADS and semi-rational design modified T7 RNA polymerase reduced dsRNA production, with lower terminal transferase and RDRP activities》闡述了一項創(chuàng)新性研究。基于這項研究成果，翌圣已向中國、美國提交了專利申請。
產(chǎn)品信息
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產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
體積 |
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Cleascrip™ T7 RNA Polymerase GMP-grade (low dsRNA, 250 U/μL) |
10629ES10 |
10KU |
40 μL |
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10629ES60 |
100 KU |
400 μL |
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10629ES86 |
2500 KU |
10 mL |
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10629ES96 |
25MU |
100 mL |
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10629ES99 |
100MU |
400 mL |