病原體引起的傳染病嚴(yán)重影響人類健康，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年因傳染病失去生命的人占總死亡人口的25%。自2020年新冠疫情爆發(fā)以來，全世界都籠罩在疫情的陰霾之下。因此在突發(fā)性傳染病爆發(fā)時(shí)，能夠快速檢測識別病原體對遏制疫情擴(kuò)散與疾病的治療至關(guān)重要[1-3]。
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主流的病原體檢測方式大多基于免疫學(xué)（如：ELISA）或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）原理，但是在突發(fā)性傳染病爆發(fā)時(shí)，制備有效的抗體所需周期較長，而基于PCR的檢測手段對設(shè)備要求較高，在一些物資匱乏的地區(qū)難以第一時(shí)間配備設(shè)備，錯(cuò)過最佳防控時(shí)機(jī)[4, 5]。
CRISPR技術(shù)在作為繼ZFN和TALEN之后的第三代基因編輯技術(shù)，在各個(gè)領(lǐng)域大放異彩。在體外診斷方面由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)對靶標(biāo)序列的精準(zhǔn)識別，造就了基于此原理的新型生物傳感器優(yōu)良的檢測性能。
基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分子診斷大致可分為兩類，一是基于切割功能的檢測方法，另一種是基于定位功能的檢測方法。
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(一)基于切割功能的檢測手法
NASBA-CRISPR Cleavage(NASBACC)技術(shù)
Cas9僅在具有PAM序列的情況下才具有切割能力，而任何隨機(jī)突變都有48%的概率創(chuàng)造一個(gè)新的PAM位點(diǎn)或者破壞現(xiàn)有的PAM位點(diǎn)，因此可以利用特異性的PAM位點(diǎn)來區(qū)分菌株的譜系。
NASBA-CRISPR Cleavage(NASBACC)[6]將依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)NASBA、toehold開關(guān)RNA傳感器和CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)合，在特異性PAM序列和gRNA靶點(diǎn)的存在下，NASBA反應(yīng)合成的雙鏈DNA被Cas9切割，截短的RNA產(chǎn)物中缺少傳感器H，所以無法激活toehold開關(guān)。而在沒有PAM序列的情況下，就可以產(chǎn)生包含傳感器H觸發(fā)序列的全長RNA產(chǎn)物，從而激活傳感器H。然后RBS和起始密碼子被釋放，激活LacZ基因翻譯表達(dá)β-半乳糖苷酶，該酶可將黃色底物（氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷）轉(zhuǎn)化為紫色產(chǎn)物（氯酚紅），從而實(shí)現(xiàn)肉眼可見的顏色變化。近岸蛋白的NLS-Cas9 Nuclease（E365）可有效對雙鏈DNA進(jìn)行切割，適用于體外剪切靶DNA的特異位點(diǎn)。
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圖1. NASBA-CRISPR 技術(shù)檢測原理[6]
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CASLFA技術(shù)
Wang X等[7]將Cas9介導(dǎo)的檢測技術(shù)整合至側(cè)流層析試紙條(Lateral flow detection，LFD) ，建立了新型的比色生物傳感系統(tǒng)CASLFA (CRISPR/Cas9- mediated lateral flow nucleic acid assay)。在這個(gè)體系中，利用生物素標(biāo)記的引物對靶標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物添加到反應(yīng)體系后，Cas9/sgRNA會特異性識別靶標(biāo)DNA并形成三元復(fù)合物。隨后將反應(yīng)底物滴加至側(cè)流層析試紙條上，在毛細(xì)作用下，液體不斷地向前流動。當(dāng)復(fù)合物流經(jīng)結(jié)合墊時(shí)，AuNP-DNA探針會與sgRNA的環(huán)狀區(qū)域結(jié)合，形成四元復(fù)合物，隨后被固定在檢測線的鏈霉親和素捕獲，而過剩的AuNP-DNA會繼續(xù)向前流動并被質(zhì)控線上的探針捕獲。由于AuNP的積累，會在檢測線與質(zhì)控線上產(chǎn)生顏色帶，通過顯色即可判斷靶DNA是否存在。近岸蛋白的Cas9 (D10A, H840A) Nuclease（E368）在Cas9 Nuclease基礎(chǔ)上突變兩個(gè)切割活性中心，使其只具有靶DNA結(jié)合活性，但無切割活性，可有效應(yīng)用于Cas9/sgRNA與目的DNA的特異性結(jié)合。
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圖2. CASLFA技術(shù)檢測原理[7]
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CAS-EXPAR技術(shù)
Cas9/sgRNA復(fù)合物對ssDNA底物進(jìn)行定點(diǎn)切割，生成產(chǎn)物片段（X）。通過DNA聚合酶催化X與EXPAR模板雜交，得到雙鏈延伸產(chǎn)物。雙鏈產(chǎn)物隨后被NEase切割形成缺口，X的一個(gè)拷貝被Vent（外）DNA聚合酶從模板上釋放出來，解離的X繼續(xù)觸發(fā)新一輪的擴(kuò)增反應(yīng)[8]。近岸蛋白的Cas9（D10A）Nickase（E366）在Cas9 Nuclease基礎(chǔ)上突變其中一個(gè)切割活性中心，其能夠在與sgRNA靶序列互補(bǔ)的單鏈DNA上產(chǎn)生切口，從而形成功能性的單鏈斷裂。
圖3. CAS-EXPAR技術(shù)檢測原理[8]
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(二)基于定位功能的檢測方法
Paired dCas9(PC)技術(shù)
Paired dCas9(PC)技術(shù)是使用一對dCas9蛋白，分別融合熒光素酶的兩個(gè)分離結(jié)構(gòu)域（NFluc和CFluc），并通過兩個(gè)靶向相鄰序列的gRNA實(shí)現(xiàn)檢測。其反應(yīng)原理如圖4所示：當(dāng)存在靶標(biāo)DNA時(shí)，兩個(gè)分別帶有熒光素酶結(jié)構(gòu)域的dCas9在gRNA的引導(dǎo)下結(jié)合到相鄰的靶標(biāo)序列上，熒光素酶的兩個(gè)分離結(jié)構(gòu)域相互靠近，形成有活性的熒光素酶，在ATP和氧氣存在條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，并產(chǎn)生可檢測的熒光信號[9]。
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圖4. Paired dCas9(PC)技術(shù)原理[9]
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dCas9/sgRNA-SG I DNA-FISH
Guk K等基于SYBR GREEN I熒光染料開發(fā)了dCas9/sgRNA-SG I DNA-FISH系統(tǒng)：即通過設(shè)計(jì)識別靶標(biāo)基因的sgRNA序列，dCas9/sgRNA復(fù)合物能夠特異性識別靶標(biāo)基因并形成三元復(fù)合物。由于dCas9蛋白帶有His標(biāo)簽，所以利用anti-His磁珠可以將三元復(fù)合物分離，最后加入SYBR GREEN I與體系中的靶標(biāo)DNA結(jié)合實(shí)現(xiàn)可視化檢測[10]。
圖5.dCas9/sgRNA-SG Ⅰ DNA-FISH技術(shù)原理[10]
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總結(jié)與展望
基于CRISPR/Cas9的新型體外檢測手段可以對多種病原微生物進(jìn)行高效精準(zhǔn)檢測。相較于傳統(tǒng)的檢測手段，CRISPR/Cas9類的生物傳感器大都不需要大型精密的儀器，對檢測場地沒有苛刻的要求，大大地降低了檢測的成本。除此之外，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與其他技術(shù)相結(jié)合，也能夠大大提高檢測的靈敏度與普適性。
基于CRISPR/Cas9的檢測手段在一些方面有著巨大優(yōu)勢，但是在病原體檢測領(lǐng)域依然有著不可避免的局限性，比如上述的NASBA-CRISPR cleavage技術(shù)，Cas9只能對靶標(biāo)序列進(jìn)行切割，一旦靶標(biāo)序列濃度過低，就會由于產(chǎn)物顏色過淺而無法讀取準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；Cas-EXPAR檢測步驟過多，所需試劑過于復(fù)雜。雖然該技術(shù)正處于起步階段，全面超越傳統(tǒng)的檢測方法仍存在一定距離，但隨著研究的不斷深入，我們有望開發(fā)出更多類型的CRISPR/Cas體系，將它們更廣泛地應(yīng)用在病原微生物的檢測中。
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參考文獻(xiàn)
[1] Broughton J P, Deng X, Yu G, et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2 [J]. Nat Biotechnol, 2020, 38(7): 870-874.
[2] Wang X, Zhong M, Liu Y, et al. Rapid and sensitive detection of COVID-19 using CRISPR/Cas12a-based detection with naked eye readout, CRISPR/Cas12a-NER [J]. Sci Bull (Beijing), 2020, 65(17): 1436-1439.
[3] Smyrlaki I, Ekman M, Lentini A, et al. Massive and rapid COVID-19 testing is feasible by extraction-free SARS-CoV-2 RT-PCR [J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 4812.
[4] Lequin R M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [J]. Clin Chem, 2005, 51(12): 2415-2418.
[5] Li Z, Zhang X, Hu X, et al. Development of an indirect ELISA assay for detecting antibodies against mammalian reovirus in pigs [J]. J Virol Methods, 2018, 262: 61-64.
[6] Pardee K, Green A A, Takahashi M K, et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components [J]. Cell, 2016, 165(5): 1255-1266.
[7] Wang X, Xiong E, Tian T, et al. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9-Mediated Lateral Flow Nucleic Acid Assay [J]. ACS Nano, 2020, 14(2): 2497-2508.
[8] Huang M, Zhou X, Wang H, et al. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 Triggered Isothermal Amplification for Site-Specific Nucleic Acid Detection [J]. Anal Chem, 2018, 90(3): 2193-2200.
[9] Zhang Y, Qian L, Wei W, et al. Paired Design of dCas9 as a Systematic Platform for the Detection of Featured Nucleic Acid Sequences in Pathogenic Strains [J]. ACS Synth Biol, 2017, 6(2): 211-216.
[10] Guk K, Keem J O, Hwang S G, et al. A facile, rapid and sensitive detection of MRSA using a CRISPR-mediated DNA FISH method, antibody-like dCas9/sgRNA complex [J]. Biosens Bioelectron, 2017, 95: 67-71.
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蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應(yīng)用解決方案的高新技術(shù)企業(yè)，主營業(yè)務(wù)為靶點(diǎn)及細(xì)胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發(fā)、生產(chǎn)和銷售，并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)。公司定位為醫(yī)療健康與生命科學(xué)領(lǐng)域原料與技術(shù)解決方案的上游供應(yīng)商，致力于為下游客戶提供及時(shí)、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品及服務(wù)，助力全球生物醫(yī)藥企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)的技術(shù)與產(chǎn)品創(chuàng)新升級。
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