編者按
當(dāng)前，隨著類器官技術(shù)的發(fā)展，腫瘤類器官已被提議作為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的模型系統(tǒng)。由于腫瘤類器官的個(gè)性化特征，其在臨床前研究中也具有巨大的潛力。
近期，一篇重要綜述《Organoids: opportunities and challenges of cancer therapy》中，一張圖簡(jiǎn)明扼要地總結(jié)了不同腫瘤類器官培養(yǎng)方法的關(guān)鍵。從腫瘤組織中通過(guò)機(jī)械或酶解獲得腫瘤細(xì)胞，用幾乎相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，而細(xì)胞因子是腫瘤類器官培養(yǎng)成功的決定因素之一。今天，我們重點(diǎn)介紹幾種重要的腫瘤類器官培養(yǎng)基組分及方案——
01、胃癌類器官培養(yǎng)
通過(guò)構(gòu)建源自胃癌患者的類器官（PDO），能夠直接對(duì)臨床樣本進(jìn)行研究。Vlachogiannis 等人為了成功培養(yǎng)胃癌類器官，除了使用 ADMEM/F12 培養(yǎng)基和基底膜基質(zhì)外，還添加了 EGF、Noggin、R-Spondin 1、FGF-10 等細(xì)胞因子。
胃癌患者的類器官（PDO）培養(yǎng)步驟：
如下實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)均引用Vlachogiannis等人發(fā)表的文章（doi: 10.1126/science.aao2774），供參考。
1. 配置 PDO 培養(yǎng)基：改良的 DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加 1x B27 additive、1x N2 additive、0.01% BSA、2 mM L-Glutamine、100 units/ml 青霉素-鏈霉素，以及如下表的細(xì)胞因子或其他添加物：
*HGF 僅用于膽管癌類器官。
2. 樣本收集：通過(guò)圖像引導(dǎo)或內(nèi)窺鏡手術(shù)收集活檢樣品。收獲后，樣本置于冷 PBS 中，并在冰上運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，20 分鐘～2 小時(shí)內(nèi)將組織切片切碎。
3. 樣本處理：組織切碎后，加入 5 ml 5 mM 的 PBS/EDTA，室溫靜置 15 分鐘。用含有 2x TrypLe 的 1 mM PBS/EDTA 5 ml 在 37 ℃ 消化 1 小時(shí)。施加機(jī)械力（如吹液）以促進(jìn)消化。
4. 接種細(xì)胞：用改良的 DMEM/F12 培養(yǎng)基收集分離的細(xì)胞，并在 4 ℃，1,200 轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘，使細(xì)胞成球狀，用 120 µl GFR 基質(zhì)膠重懸，接種到 24 孔或 48 孔的平底細(xì)胞培養(yǎng)板中。
5. 將基質(zhì)在 37 ℃、5% CO2 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 20 分鐘，進(jìn)行固化。然后添加 500 µl 配置好的 PDO 培養(yǎng)基，要完全覆蓋培養(yǎng)孔。
6. 每?jī)商鞊Q一次培養(yǎng)基。
腫瘤類器官培養(yǎng)主要步驟
02、肝癌類器官培養(yǎng)
腫瘤類器官的培養(yǎng)非常復(fù)雜，如肝癌類器。原發(fā)性肝細(xì)胞癌主要分為肝細(xì)胞癌（HCC）、膽管細(xì)胞癌（CC）和混合型（CHC）。在肝細(xì)胞癌類器官培養(yǎng)中需要使用地塞米松但是膽管細(xì)胞性肝細(xì)胞癌類器官培養(yǎng)則需加入 R-spondin 1 來(lái)維持細(xì)胞生長(zhǎng)。
Broutier 等人發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌（PLC）組織培養(yǎng)獲得的類器官可以在體外真實(shí)地模擬人類 PLC 的遺傳復(fù)雜性。構(gòu)建的類器官包含 PLC 常見(jiàn)的三種亞型：HCC、CC 和 CHC，再現(xiàn)親本腫瘤的組織結(jié)構(gòu)和表達(dá)譜，同時(shí)保留患者及亞型之間的差異性，有利于肝癌相關(guān)基因和潛在生物標(biāo)志物的鑒定。
肝癌類器官分類培養(yǎng)基：
如下實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)均引用 Broutier 等人發(fā)表的文章（doi: 10.1038/nm.4438），供參考。
1. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：改良的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，添加 1% 青霉素-鏈霉素、1% Glutamax、10 mM HEPES 和 1:50 B27 添加劑。
2. 經(jīng)典人肝類器官分離培養(yǎng)基：Wnt 條件培養(yǎng)基、R-Spondin 1 條件培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基按照 30%、10% 和 70% 的體積比混合，然后加入 1:100 N2 添加劑、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、10 nM 重組人 Gastrin I、50 ng/ml 重組人EGF、100 ng/ml 重組人 FGF10、25 ng/ml 重組人 HGF、25 ng/ml Noggin、5 uM A83-01、10 uM Forskolin、10 uM Y27632。
3. 腫瘤細(xì)胞特異性分離培養(yǎng)基：經(jīng)典人肝類器官分離培養(yǎng)基中添加 3 mM 地塞米松。
4. 肝癌類器官培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10% （體積比）R-Spondin 1 條件培養(yǎng)基、1:100 N2 添加劑、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、10 nM 重組人 Gastrin I、50 ng/ml 重組人 EGF、100 ng/ml 重組人 FGF10、25 ng/ml 重組人 HGF、5 uM A83-01、10 uM Forskolin。
03、結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)
患者來(lái)源的腫瘤類器官已成為結(jié)直腸癌臨床前研究的一種出色的模型，原代上皮細(xì)胞可在特定生長(zhǎng)因子的控制下和 3D 細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中成功培養(yǎng)類器官。腸上皮細(xì)胞的自我更新由位于隱窩中的 Lgr5 干細(xì)胞驅(qū)動(dòng)。Wnt 信號(hào)是維持隱窩干細(xì)胞活躍所必需的，Wnt 激動(dòng)劑 R-Spondin 1 是 Lgr5 的配體，誘導(dǎo)隱窩增生。EGF 信號(hào)與腸道增殖有關(guān)，Noggin 誘導(dǎo)隱窩數(shù)量的急劇增加。
因此，van de Wetering 等人開(kāi)發(fā)的結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)體系如下：
如下實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)均引用 van de Wetering 等人發(fā)表的文章（doi: 10.1016/j.cell.2015.03.053），供參考。
1. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：改良的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，添加青霉素-鏈霉素、10 mM HEPES 和 Glutamax。
2. 人腸干細(xì)胞培養(yǎng)基：Wnt 條件培養(yǎng)基、R-Spondin 1 條件培養(yǎng)基、Noggin 條件培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基按照 50%、20%、10% 和 20% 的體積比混合，然后加入 1x B27、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、50 ng/ml 人 EGF、10 nM Gastrin、500 nM A83-01、3 uM SB202190、10 nM Prostaglandine E2 和 100 mg/ml Primocin。
3. H&E 染色分析：通過(guò) H&E 染色對(duì)培養(yǎng)后的原代腫瘤細(xì)胞和類器官進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)類器官的特征是存在一個(gè)或多個(gè)管腔，與原代腫瘤的管狀結(jié)構(gòu)相似（如 P8 和 P19b），沒(méi)有管腔的原代腫瘤會(huì)形成沒(méi)有管腔的緊湊型類器官（P19a）。
腫瘤類器官與原代腫瘤上皮相似
04、乳腺癌類器官培養(yǎng)
乳腺癌類器官的培養(yǎng)基與其他腫瘤的略有不同。Seino 等人在類器官培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Neuregulin 1 與乳腺發(fā)育和腫瘤發(fā)生有關(guān)，將其添加到培養(yǎng)基中可維持類器官有效再生和長(zhǎng)期增殖（超過(guò) 20 代）。Wnt-3A 對(duì)類器官培養(yǎng)條件改善不明顯。EGF 對(duì)乳腺癌類器官培養(yǎng)具有雙重作用，高于 5 ng/ml 促進(jìn)細(xì)胞增殖，但會(huì)導(dǎo)致類器官解體，失去自組織功能，低濃度則相反。
Hans Clevers 等構(gòu)建乳腺癌類器官的培養(yǎng)基組分：
如下實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)均引用 Hans Clevers 等人發(fā)表的文章（ doi 10.1016/j.cell.2017.11.010 ），供參考。
a：類器官出現(xiàn)解體時(shí)減少或不添加，b：濃度超過(guò) 1 μM 會(huì)降低類器官生成效率
05、肺癌類器官培養(yǎng)
肺癌是全球常見(jiàn)的惡性實(shí)體腫瘤，但是肺癌早期臨床表現(xiàn)不明顯，容易與其他感染混淆而被忽視，一般確診時(shí)已發(fā)展到中晚期，因此，及時(shí)準(zhǔn)確地篩選合適的抗腫瘤藥物對(duì)肺癌患者非常重要。
1 份從原發(fā)性腫瘤組織中衍生出肺腺癌類器官（成功率達(dá)到 80%）的培養(yǎng)基組分：
如下實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)均引用Zhichao Li等人發(fā)表的文章（10.1016/j.xpro.2020.100239 ），供參考。
試劑詳細(xì)配制指南
關(guān)鍵：所有操作都應(yīng)在二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行，以保持無(wú)菌狀態(tài)。
1、200 μg/mL FGF-10 (10,000 X)
a. 取100 μg溶于0.5 mL 無(wú)菌的 PBS（加 0.1% BSA，質(zhì)量/體積）。
b. 每管 5 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個(gè)月。
2、250 μg/mL FGF-7 (12,500 X)
a. 取 100 μg 溶于 0.4 mL 無(wú)菌的 PBS（加 0.1% BSA，質(zhì)量/體積）。
b. 每管 4 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個(gè)月。
3、100 μg/mL R-spondin 1 (200 X)
a. 取 250 μg 溶于 2.5 mL 無(wú)菌的 PBS（加 0.1% BSA，質(zhì)量/體積）。
b. 每管 250 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 1 個(gè)月。
4、100 μg/mL Noggin (1,000 X)
a. 取 100 μg 溶于 1 mL 無(wú)菌的 PBS（加 0.1% BSA，質(zhì)量/體積）。
b. 每管 50 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 2 個(gè)月。
5、100 mM Y-27632 dihydrochloride (10,000 X)
a. 取 50 mg 溶于 1.56 mL 的超純水中。
b. 用 0.22 μm 的過(guò)濾器過(guò)濾溶液。
c. 每管 5 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 6 個(gè)月。
6、500 mM N-Acetylcysteine (400 X)
a. 取 408 mg 溶于超純水，至終體積為 5 mL。
b. 用 0.22 μm 的過(guò)濾器過(guò)濾溶液。
c. 每管 125 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個(gè)月。
7、2 M Nicotinamide (200 X)
a. 取 6.1 g 溶于 1x PBS，至終體積為 25 mL。
b. 用 0.22 μm 的過(guò)濾器過(guò)濾溶液。
c. 每管 250 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個(gè)月。
8、30 mM SB202190 單鹽酸鹽水合物 (3,000 X)
a. 取 5 mg 溶于 0.453 mL 的二甲基亞砜（DMSO）中
b. 每管 16.67 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的黑色離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個(gè)月。
關(guān)鍵：不要用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜過(guò)濾含有 DMSO 的溶液，因?yàn)?DMSO 可以溶解這種膜。
關(guān)鍵：使用黑色離心管，防止該溶液受到光照。
建議：過(guò)濾 DMSO 溶液，可以使用 DMSO 安全過(guò)濾器或尼龍膜過(guò)濾器。
9、25 mM A83-01 (50,000 X)
a. 取 5 mg 溶于 0.474 mL 的二甲基亞砜（DMSO）中
b. 每管 2 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個(gè)月。
10、分裝基質(zhì)膠
a. 取一瓶新的基質(zhì)膠，放于 4 ℃ 冰箱中解凍 8 小時(shí)。
b. 將瓶子倒置幾次，使其充分混合。
c. 取 1.5 mL 的離心管置于冰上冷卻。
d. 將基質(zhì)膠和 1.5 mL 的離心管置于冰上，按實(shí)驗(yàn)所需體積將基質(zhì)膠分裝到 1.5 mL 的離心管中，并在 -20 ℃ 保存。
關(guān)鍵：移液器槍頭應(yīng)在抽吸基質(zhì)膠之前，為了防止基質(zhì)膠黏在槍頭上，應(yīng)通過(guò)多次抽吸和排出冷的無(wú)菌 PBS（含 01.% BSA）進(jìn)行預(yù)濕和預(yù)冷。
注意：基質(zhì)膠是一種重組基膜制劑，富含胞外蛋白，應(yīng)避免反復(fù)凍融。
06、卵巢癌類器官培養(yǎng)
目前，培養(yǎng)卵巢癌類器官的方法有多種，但成功率較高的是使用基質(zhì)膠和改良 DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組合，并輔以 EGF、FGF2、FGF10、Noggin、Rspondin1、p38 抑制劑等，可使類器官培養(yǎng)成功率達(dá)到 80%～90%。
Senkowski 等人為了獲得高級(jí)別漿液性卵巢癌（HGSC）類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)方案，對(duì)培養(yǎng)基添加組分進(jìn)行優(yōu)化，獲得兩種成功率更高的配方。并且體外培養(yǎng)的 HGSC 類器官保留了原始腫瘤的基因組和表型特征，其藥物反應(yīng)與臨床結(jié)果具有相關(guān)性。
培養(yǎng)基優(yōu)化主要涉及添加物種類和濃度，尤其是細(xì)胞因子類。
研究人員在改良型 DMEM/F12 培養(yǎng)基中加入 Glutamax、Primocin、N-acetyl-cysteine 和 B27 添加劑構(gòu)成基礎(chǔ)培養(yǎng)基。通過(guò)分析添加劑對(duì) HGSC 原代細(xì)胞短期類器官形成和生長(zhǎng)的影響，使用添加 FGF-10、SB202190 和 A83-10 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M 0.1）進(jìn)行優(yōu)化。但 M 0.1 培養(yǎng)基能促進(jìn)生長(zhǎng)，但在傳代后并不能維持生長(zhǎng)。進(jìn)一步確定 HGSC 類器官培養(yǎng)基配方中加入了 5 mM 煙酰胺，形成培養(yǎng)基 M1。
在培養(yǎng)基 M1 中添加 EGF、Heregulin-β-1、Hydrocortisone 和 Forskolin，形成培養(yǎng)基 M2。對(duì)于不同的樣品，M2 可能具有促進(jìn)或抑制類器官生長(zhǎng)的「矛盾」結(jié)果，因此為了最大限度地提高類器官形成，每個(gè) HGSC 樣品應(yīng)在兩種不同的培養(yǎng)基 M1 和 M2 中平行培養(yǎng)。
類器官形成和長(zhǎng)期培養(yǎng)測(cè)試的主要因子及其影響概述：
腫瘤類器官與原代腫瘤上皮相似
07、其他腫瘤類器官培養(yǎng)
膀胱癌類器官利用 CTOS 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，主要成分為改良型 DMEM/F12、B27、A83-01，需補(bǔ)充添加 FGF10、FGF7、HER3。
培養(yǎng)前列腺類器官時(shí)，一般會(huì)加入 FGF10、FGF2、p38 抑制劑 SB202190、Rho 激酶抑制劑等，而小鼠前列腺癌類器官無(wú)需添加 FGF10、FGF2、PGE2、煙酰胺和 SB202190……
總之，不同腫瘤類器官培養(yǎng)需要添加不同組合的細(xì)胞因子，以促進(jìn)或抑制參與類器官形成的信號(hào)通路，獲得所需的類器官。腫瘤類器官培養(yǎng)作為一種具有廣泛應(yīng)用前景的技術(shù)，通過(guò)不斷優(yōu)化和完善培養(yǎng)方法，有望為腫瘤研究和治療提供新的突破。