淋巴結(jié)是一種次級淋巴器官，可以通過細胞間的緊密相互作用來誘導適應性免疫反應。淋巴結(jié)中的生發(fā)中心的結(jié)構(gòu)，是B細胞和濾泡輔助CD4+ T細胞聚集并促進抗體成熟的地方。而未分化的T細胞則通過CCR7介導的趨化作用進入淋巴結(jié)的髓質(zhì)區(qū)，之后被抗原呈遞細胞激活。激活后的T細胞可以通過S1P介導的出流機制重新進入淋巴循環(huán)，這被CD69抑制在激活的和LN駐留的細胞上。生發(fā)中心CD8+ T細胞（fCD8）與對多種病毒感染和癌癥的免疫控制有關(guān)。盡管fCD8與免疫控制有關(guān)，但這些細胞的效應機制還沒有完全明確。
2023年5月19日，美國哈佛醫(yī)學院麻省總醫(yī)院Ragon研究所主任Bruce D. Walker教授團隊在Science Immunology上發(fā)表題為“Cytolytic CD8+ T cells infiltrate germinal centers to limit ongoing
HIV replication in spontaneous controller lymph nodes”的研究論文。
文章探討了在沒有用藥的情況下控制HIV感染的人群中，淋巴結(jié)內(nèi)病毒特異性CD8+ T細胞的功能、克隆組成、空間定位、表型特征和轉(zhuǎn)錄譜。結(jié)果顯示，抗原誘導的增殖和細胞毒性潛能一致地區(qū)分了自發(fā)控制者和非控制者。T細胞受體分析揭示了外周血和淋巴結(jié)內(nèi)HIV特異性CD8+ T細胞之間的完全克隆重疊。淋巴結(jié)CD8+ T細胞的轉(zhuǎn)錄分析顯示了炎癥趨化因子和抗原誘導效應功能的基因特征。在HIV控制者中，細胞毒效應分子穿孔素和顆粒酶B在濾泡中靠近HIV RNA熱點的病毒特異性CXCR5+ fCD8中升高。這些結(jié)果與fCD8通過炎癥招募、抗原特異性增殖和細胞毒性來控制淋巴濾泡感染的證據(jù)一致。
實驗部分
本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS全景組織細胞定量分析系統(tǒng)對淋巴結(jié)組織樣本進行多色熒光圖像采集。
在本文中作者表示，因為樣本來源所限，無法獲得足夠的來自非控制者的 T 細胞用于與控制者的 HIV 特異性
CD8 +直接用于轉(zhuǎn)錄組學比較。為了解決這個問題，作者采取了更為直接的策略：即通過單細胞分辨率的細胞功能測定的方法，從組織原位抓取細胞的作用關(guān)系，以此驗證及推斷GC 訪問和持續(xù)的細胞溶解潛力是 LN 中長期病毒控制的關(guān)鍵決定因素，并將為引發(fā)對淋巴細胞感染和癌癥的免疫控制提供更多的信息。
在組織原位單細胞分辨率的功能測定部分，研究者使用了Tissue Cytometry技術(shù)作為支撐。Tissue Cytometry技術(shù)組織原位整體解決方案不但可以提供真實的切片原位成像結(jié)果（相對的一些玻片掃描儀會通過AI針對掃描圖像進行優(yōu)化），而且在真實的成像結(jié)果之上對細胞密度極高的淋巴結(jié)內(nèi)部單個細胞進行了精準的數(shù)據(jù)定量分析，結(jié)合其中穿孔素顆粒酶、CD8+細胞的分布以及病毒顆粒的表達情況，提出fCD8 通過抗原驅(qū)動的增殖和正在進行的病毒復制位點的瞬時細胞毒性來維持對感染的自發(fā)控制。
與單獨轉(zhuǎn)錄組學分析數(shù)據(jù)相比，采用Tissue
Cytometry技術(shù)相結(jié)合的文章數(shù)據(jù)更加準確翔實，驗證結(jié)論更加可靠。
- TissueFAXS對淋巴結(jié)樣本圖像采集。（細胞核（DAPI）、HIV gagpol RNA（白色）、CD8（紅色）、perforin（黃色）和granzyme B（藍色））
- StrataQuest軟件對淋巴結(jié)組織樣本上的圖像進行組織區(qū)域識別和計數(shù)，確定每個細胞核是否表達HIV RNA和CD8、perforin、granzyme B等蛋白。
- StrataQuest軟件根據(jù)細胞形態(tài)、CD8的分布和IgD陽性的B細胞來確定淋巴結(jié)濾泡生發(fā)中心的范圍。
- 為了評估細胞毒性和非細胞毒性fCD8細胞與最近的HIV gagpol RNA陽性細胞之間的距離，從圖像分析報告中提取了HIV gagpol RNA陽性細胞、穿孔素+顆粒酶B+ CD8+細胞和穿孔素- CD8+細胞的x-y坐標。
Fig 1 HIV復制過程中控制型淋巴結(jié)中存在細胞毒性的CD8+T細胞
(A)
自發(fā)控制型淋巴結(jié)的多色免疫熒光(IF)和RNA Scope圖像：HIV gagpol RNA(白色)、CD8(紅色)、穿孔素(黃色)和顆粒酶B(藍色)。毛
(B)
淋巴結(jié)組織切片中，共表達CD8+細胞的穿孔素/顆粒酶B細胞密度與HIV
gagpolRNA的細胞密度之間的Spearman相關(guān)性。
(C)
根據(jù)形態(tài)學識別，確定濾泡性生發(fā)中心(ROI)，根據(jù)相鄰切片的形態(tài)、相對CD8排除(紅色)和IGD染色(綠色)以橙色線條劃分。
(D)
濾泡性生發(fā)中心共表達CD8+細胞的穿孔素/顆粒酶B細胞與表達HIV
gagpolRNA的細胞之間的Spearman相關(guān)性。
Fig 2 fCD8在生發(fā)中心HIV感染細胞近端的細胞溶解效應分子
（A）通過DAPI定位，在多色免疫熒光和RNA scope圖像上識別細胞邊界。在生發(fā)中心區(qū)域內(nèi)，識別出HIV gagpol
RNA+細胞（綠色）、CD8+穿孔素-細胞（灰色）或CD8+穿孔素+顆粒酶B+細胞（青色）。
（B）在離最近的HIV gagpol RNA+細胞的指定距離范圍內(nèi)，表達穿孔素和顆粒酶B的fCD8細胞數(shù)量（以平均細胞直徑相當于8.3 μm增量表示），以細胞數(shù)（右軸，青色）和每個距離范圍內(nèi)總fCD8細胞的百分比（左軸，紅色，Spearman相關(guān)性）進行表示。