編者按
腸道菌群是近年來中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點，不僅與中醫(yī)理論相契合，而且是中藥口服發(fā)揮藥效的重要靶點之一。基于腸道菌群的中藥藥理研究近年來也陸續(xù)刊登于核心期刊。
為了幫助廣大研究者了解中醫(yī)藥相關(guān)腸道微生物的研究進(jìn)展與方法，我們收集整理了近幾年基于中藥及腸靶軸研究的發(fā)表于GUT、Nature Communications、Theranostics等高水平期刊的論文。
【中醫(yī)藥與腸道菌群專輯】為大家精細(xì)解讀重磅研究與進(jìn)展。
【文獻(xiàn)名稱】Gut microbiota-derived inosine from dietary barley leaf supplementation attenuates colitis through PPARγ signaling activation
【雜志名】：Microbiome
【影響因子】：IF=11.607
【中藥】：大麥葉
【疾病】：結(jié)腸炎
【樣本類型】：葡聚糖硫酸鈉 (DSS) 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型
【技術(shù)方法】：非靶向代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組、16s
【關(guān)鍵菌群】：Lactobacillus
【是否菌群驗證】：代謝物肌苷功能活性驗證
研究背景
【中藥背景】大麥葉(Barley leaf, BL)是大麥的幼草，是亞洲地區(qū)綠色功能性飲料的主要成分，也一種中草藥成分。既往研究報道了大麥葉(BL)的抗氧化特性。此外，BL對腸道功能有潛在的健康促進(jìn)作用。
【疾病和腸道菌群】炎癥性腸病主要包含潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。最近的研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎在發(fā)展中國家變得越來越頻繁，已成為全球公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。潰瘍性結(jié)腸炎的病因尚不完全清楚，已有研究表明結(jié)腸上皮PPARγ表達(dá)降低是導(dǎo)致腸道功能障礙和慢性炎癥的重要因素。臨床上PPARγ是5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素等抗炎藥物的重要靶點，然而大多以藥物為基礎(chǔ)的干預(yù)措施缺乏特異性，存在副作用。在腸道微生物研究方面，通過腸道微生物植物移植可以將結(jié)腸粘液層的不同性質(zhì)轉(zhuǎn)移給無菌小鼠。腸易激綜合征患者的腸道菌群移植可能導(dǎo)致無菌小鼠腸道運動和屏障功能的改變，靶向腸道微生物群可能是預(yù)防和治療結(jié)腸炎的有效途徑。
本研究以小鼠結(jié)腸炎為模型，大麥葉(BL)顯著減輕了疾病的嚴(yán)重程度和微生物群失調(diào)。腸道微生物衍生的嘌呤代謝產(chǎn)物肌苷通過腺苷2A受體(A2AR)-PPARγ信號介導(dǎo)BL對腸道功能的有益影響。該研究為BL保護(hù)結(jié)腸炎的潛在機制提供了新的見解，并突出了BL和肌苷在預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎中的潛在應(yīng)用。相關(guān)研究成果發(fā)表于頂級期刊《Microbiome》。
研究路線
主要研究結(jié)果
一、藥效研究：大麥葉（BL)減輕葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎
小鼠經(jīng)葡聚糖硫酸鈉 (DSS) 誘導(dǎo)后，上皮細(xì)胞屏障會受到化學(xué)損害，導(dǎo)致腸道穩(wěn)態(tài)的破壞和腸道微生物群的失調(diào)。對照組飼喂標(biāo)準(zhǔn)鼠糧(CD)，BL組在標(biāo)準(zhǔn)鼠糧基礎(chǔ)上添加2.5%大麥葉（BL)。
(1) 表型指標(biāo)變化
對照組和BL組小鼠在食物和水?dāng)z入量無差異，表明BL對飲食習(xí)慣沒有影響。BL顯著緩解DSS誘導(dǎo)的體重減輕、疾病指數(shù)(DAI)評分降低和結(jié)腸縮短，也顯著保護(hù)了腸道通透性(圖b-e)。
(2) 炎癥因子改變
炎癥因子是結(jié)腸炎發(fā)病的關(guān)鍵因素，BL顯著提高小鼠血清IL-4和IL-10水平，降低TNF-α水平，在結(jié)腸組織的結(jié)果與血清一致。這表明BL有效減輕DSS治療小鼠的結(jié)腸炎癥狀。
(3) 腸道菌群失調(diào)
潰瘍性結(jié)腸炎通常與腸道菌群失調(diào)有關(guān)，DSS處理誘導(dǎo)了腸道菌群失調(diào)(圖f)。相比DSS組，BL+DSS組的微生物群更接近于CD和BL組，這表明BL對DSS誘導(dǎo)的菌群失調(diào)有保護(hù)作用。BL顯著緩解DSS誘導(dǎo)的細(xì)菌豐度和多樣性下降(圖g)。
在門和科水平，BL顯著降低DSS誘導(dǎo)的Proteobacteria相對豐度增加（圖h）；DSS處理導(dǎo)致腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的豐度急劇增加，這是腸道菌群失調(diào)的常見特征，而補充BL能緩解上述菌群變化（圖i）。
(4) 前期預(yù)防有助于緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎
為了評估預(yù)防性或治療性環(huán)境是否有助于預(yù)防DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，分別在DSS治療前(beBL)或期間(duBL)小鼠補充BL。beBL治療組改善了小鼠體重減輕、DAI嚴(yán)重程度和結(jié)腸長度縮短，效果與BL組相似。同樣，結(jié)腸切片組織學(xué)分析顯示，CD+DSS組和duBL+ DSS組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的固有層和粘膜下層的隱窩扭曲、杯狀細(xì)胞丟失和炎癥細(xì)胞浸潤，而beBL+DSS組和BL+DSS組的炎癥細(xì)胞浸潤明顯消失。綜上所述，飼糧中添加BL可預(yù)防DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎和腸道微生物群失調(diào)。
二、功能研究：BL增強結(jié)腸蠕動，改善黏膜屏障功能
(1) 腸道形態(tài)學(xué)與結(jié)腸蠕動
BL處理組的結(jié)腸隱窩高度和肌肉層寬度顯著增加（圖a-c)，而小腸中未觀察到形態(tài)學(xué)改變。肌肉層的協(xié)調(diào)收縮可促進(jìn)腸道運動，BL組小鼠大便頻率的確相應(yīng)地增加，且腸道轉(zhuǎn)運時間縮短。電鏡圖像顯示，BL組表現(xiàn)出超形態(tài)學(xué)的顯著改變，說明BL可通過改善腸道屏障功能提升保護(hù)效應(yīng)。相比之下，緊密連接蛋白和和抗菌肽表達(dá)水平并沒有差異，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤水平也基本相當(dāng)。
(2) BL對粘膜屏障功能的影響
為了進(jìn)一步考察BL對粘膜屏障功能的保護(hù)作用，作者重點關(guān)注了結(jié)腸黏液層的改變。Alcian blue staining 染色顯示，BL組結(jié)腸杯狀細(xì)胞顯著增加，其粘蛋白顆粒在粘膜表面的頂端胞吐作用和分泌也增強（圖g-i）。粘蛋白2 (Muc2) 是形成粘液層的最豐富的粘蛋白，被高度糖基化并由杯狀細(xì)胞分泌。免疫組化顯示Muc2陽性的杯狀細(xì)胞明顯增多，透射電鏡分析進(jìn)一步證實了上述結(jié)果。
三、信號通路研究：BL 作用依賴于PPARγ 信號通路
(1) 結(jié)腸組織基因表達(dá)譜與PPARγ 信號激活指標(biāo)變化
為進(jìn)一步闡明BL對小鼠腸道運動和黏膜屏障功能改善的機制，研究者進(jìn)行了結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示：BL組小鼠結(jié)腸912個基因上調(diào)，823個基因下調(diào)，PPAR信號是最顯著富集的功能通路，而富含PPAR信號的顯著改變的基因主要參與營養(yǎng)代謝，如脂質(zhì)生物合成、降解、儲存和轉(zhuǎn)運等，這與之前研究一致。STRING分析進(jìn)一步描述顯著變化基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖3a-d)。
定量 PCR顯示，Pparg是 BL組變化最顯著的基因（圖e)。免疫熒光成像顯示：BL組結(jié)腸組織PPARγ 蛋白表達(dá)增加（圖f）。以上表明，BL 處理導(dǎo)致與營養(yǎng)代謝相關(guān)的基因發(fā)生改變，PPARγ 信號的激活可能有助于BL對腸道功能的影響。
(2) BL調(diào)控腸道功能依賴于PPARγ 信號
為了評估PPARγ信號通路是否與改善腸道功能有關(guān)，研究用PPARγ信號拮抗劑GW9662每日灌胃給小鼠。GW9662抑制PPARγ信號通路：消除了BL對肌肉層寬度、糞便頻率、腸道蠕動（圖c-e）的改善作用；減少了產(chǎn)生Muc的杯狀細(xì)胞的數(shù)量；降低了結(jié)腸炎的保護(hù)作用（包括體重、DIA得分、腸道通透性、結(jié)腸長度等）(圖4g- j)；減緩了BL對DSS誘導(dǎo)的上皮損傷的保護(hù)作用(圖4k-l)。綜上所述，這些結(jié)果表明BL可能通過激活PPARγ信號通路來保護(hù)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。
四、深入機理研究：BL促進(jìn)腸道微生物群來源的嘌呤代謝物的富集
膳食營養(yǎng)素對微生物的代謝物的調(diào)節(jié)具有很大影響，被認(rèn)為是宿主-微生物群相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)。BL影響腸功能的潛在機制可能是通過腸道微生物產(chǎn)生的代謝物。
(1) BL對腸道內(nèi)容物和血清的代謝組影響
對BL和對照小鼠的結(jié)腸內(nèi)容物和血清進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析, 代謝水平發(fā)生顯著變化，結(jié)腸內(nèi)容物16種代謝物上調(diào)、7種下調(diào)，血清中14種代謝物上調(diào)，14種下調(diào)(圖c-d)。顯著富集通路多與葡萄糖、脂質(zhì)和氨基酸代謝等能量和養(yǎng)分代謝相關(guān)，嘌呤代謝是最為顯著影響的途徑(圖e-f)。而參與嘌呤代謝中間代謝物肌苷和鳥苷變化也最為顯著，經(jīng)體外發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行了進(jìn)一步驗證。
(2) 抗生素處理驗證微生物對代謝物的直接影響
為進(jìn)一步判斷腸道微生物群是否與BL喂養(yǎng)小鼠中肌苷和鳥苷的富集有關(guān)，進(jìn)行廣譜抗生素處理，結(jié)果顯示：抗生素治療顯著降低了這兩種嘌呤代謝物的水平（圖g-h)。
(3) BL通過腸道微生物群影響結(jié)腸組織中的代謝重編程
BL通過腸道菌群影響肌苷和鳥苷的富集，可能進(jìn)一步影響對腸道功能。非靶代謝組研究表明，BL組和對照組結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯的代謝物聚類，顯著差異的代謝物大多與能量代謝有關(guān)，表明 BL可能通過增強糖酵解途徑促進(jìn)結(jié)腸運動。抗生素處理后，BL引起的代謝改變消除。以上結(jié)果表明BL通過腸道微生物群依賴性方式誘導(dǎo)結(jié)腸組織中的代謝重編程。
(4) 體外驗證微生物對肌苷、鳥苷產(chǎn)生機制
新鮮小鼠糞便培養(yǎng)BL體外發(fā)酵后，肌苷和鳥苷水平顯著增加。為了闡明肌苷和鳥苷積累的機制，通過16S測定培養(yǎng)12h和24h的菌群組成，BL發(fā)酵組多樣性下降，表明BL發(fā)酵導(dǎo)致特定細(xì)菌類群的損失。BL能顯著提高Lactobacillus的豐度，且Lactobacillus的豐度與肌苷和鳥苷的濃度呈顯著正相關(guān)（R=0.89-0.93）。以上結(jié)果顯示：Lactobacillus可能有助于肌苷和鳥苷的富集。
五、體外機理驗證：肌苷激活人結(jié)腸上皮細(xì)胞中的 PPARγ 信號及功能
為驗證代謝物能夠直接影響腸上皮細(xì)胞的功能，研究者在體外評估了肌苷和鳥苷的功能活性。用肌苷處理后，細(xì)胞中 PPARγ-熒光素酶活性顯著增加，但在鳥苷處理的細(xì)胞中沒有效果（圖c-d），表明肌苷而非鳥苷可能是BL 誘導(dǎo)的PPARγ信號激活的代謝物。
此外， PPARγ 信號通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)顯著增加，如脂質(zhì)降解基因Lpl、脂質(zhì)生物合成基因Scd1等（圖e-f）。蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光成像進(jìn)一步證實肌苷添加引起的PPARγ 蛋白水平升高（圖g-i）。
進(jìn)一步通過 siRNA抑制 PPARγ 表達(dá)及PPARγ敲低細(xì)胞研究，證明肌苷至少部分通過腺苷2A受體(A2AR)/ PPARγ途徑誘導(dǎo)粘蛋白的表達(dá)。
六、體內(nèi)機理驗證：肌苷通過 A2AR/PPARγ改善腸道功能及結(jié)腸炎
(1) 腸組織PPARγ激活
肌苷處理導(dǎo)致結(jié)腸組織中PPARγ及其靶基因的表達(dá)顯著增加（圖a-c）。
(2) 腸道形態(tài)及腸蠕動及腸粘膜屏障功能
肌苷對腸道形態(tài)的影響與BL處理一致：結(jié)腸肌肉層寬度顯著增加（圖d-e)，進(jìn)而增加排便頻率和減少腸道轉(zhuǎn)運時間來增強腸道蠕動（圖f-g)。肌苷處理增加產(chǎn)生粘液的杯狀細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而改善粘膜屏障功能（圖h）。反之，用 GW9662或A2AR特異性拮抗劑SCH58261處理后，肌苷未能誘導(dǎo)上述作用（圖e-h)。
(3) 對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎保護(hù)作用
肌苷減少了 DSS 誘導(dǎo)的體重減輕、減弱的 DAI 評分和結(jié)腸縮短（圖i-k），增強屏障功能并改善腸道通透性和組織學(xué)損傷（圖l-n）。當(dāng)GW9662或SCH58261治療，肌苷對結(jié)腸炎的有益作用消失（圖i-n）。以上研究表明：肌苷對結(jié)腸炎發(fā)揮保護(hù)作用部分通過A2AR / PPARγ 信號傳導(dǎo)。
主要結(jié)論
大麥葉（BL）可改善葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的腸道微生物群失調(diào)，其對結(jié)腸炎的保護(hù)機制：通過腸道微生物產(chǎn)生腺苷，腺苷激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ信號通路，進(jìn)而改善腸粘膜屏障等功能。此外，肌苷補充的外源性治療可產(chǎn)生與BL相似的結(jié)腸炎保護(hù)作用。本研究為BL對結(jié)腸炎保護(hù)作用潛在機制提供了新的見解，并論證BL和肌苷在預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎中的潛在應(yīng)用。
該研究的整體思路非常清晰，從表型藥效到機理追溯層層遞進(jìn)：藥效←功能←信號通路←活性分子→ 體外活性與機制驗證→體內(nèi)活性與機制驗證。
