肝臟是人體中最大的器官之一，是調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)吸收和代謝的主要器官，能夠中和攝入的有毒化合物，并產(chǎn)生體內(nèi)近50%的循環(huán)蛋白質(zhì)。肝臟由多種細(xì)胞類型組成，其中占比最高的是功能多樣的肝細(xì)胞。
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肝臟作為重要的“解毒”器官，在執(zhí)行日常功能時(shí)會(huì)受到各種代謝、病毒的侵害，可能會(huì)導(dǎo)致不同程度的肝損傷。長(zhǎng)期損傷形成的纖維化疤痕破壞了肝臟的完整性，并且還會(huì)誘導(dǎo)門靜脈高血壓等其它疾病。在大多數(shù)肝臟疾病和藥物誘導(dǎo)的肝損傷(DILI)中，損傷始于肝細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)激活其它類型細(xì)胞（如：KC和HSC）。因此，為了充分理解每種肝病的表型和損傷器官的機(jī)制，我們需要建立復(fù)雜的體外肝模型，以便于更好地進(jìn)行肝臟相關(guān)的疾病和毒性研究。
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本篇文章基于Nature protocols【1】和Journal of hepatology【2】發(fā)表的兩篇文章，整理了人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human iPSCs）來(lái)源的肝臟類器官培養(yǎng)方案。
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圖1. 人iPSCs來(lái)源的肝類器官培養(yǎng)方案【2】
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細(xì)胞來(lái)源
Human iPSCs
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培養(yǎng)基配方
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iPSCs培養(yǎng)和傳代
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1.將100mm培養(yǎng)皿包被5ml 0.1%（w/v）的明膠，室溫靜置15min至明膠凝固。
2.在明膠上接種絲裂霉素處理過的MEFs細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞數(shù)約為1.8×106個(gè)。放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度70-80%時(shí)進(jìn)行傳代。
3.吸去MEFs培養(yǎng)基，將iPSCs接種于明膠上，添加10ml iPSCs（I）培養(yǎng)基，放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。
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定向內(nèi)胚層分化
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4.?在60mm培養(yǎng)皿中加入2ml Matrigel，室溫靜置2h并添加DMEM-F12培養(yǎng)基至完全沒過Matrigel。
5.?用不含Ca2+/Mg2+的PBS沖洗iPSCs后，加入300μl Accutase，37℃孵育3-4min。
6.?將消化下來(lái)的細(xì)胞懸液收集并90g離心5min，收集細(xì)胞沉淀并加入iPSCs（II）培養(yǎng)基，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
7.?將iPSCs接種在Matrigel平板上，接種密度為1.5×106個(gè)/60mm平皿，接種后添加4ml iPSCs（II）培養(yǎng)基，放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
8.?接種后第二天，用DEs培養(yǎng)基進(jìn)行換液，放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，每2天換液一次。
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肝內(nèi)胚層分化
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9.?用HEs培養(yǎng)基進(jìn)行換液，放置在37℃，5%低氧的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
10.?用HEs（II）培養(yǎng)基進(jìn)行換液，放置在37℃，5%低氧的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，之后轉(zhuǎn)移至常氧條件下培養(yǎng)8天，達(dá)到肝成熟。
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類器官培養(yǎng)
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11.?肝成熟后的9-12天，在單層肝細(xì)胞上會(huì)出現(xiàn)三維結(jié)構(gòu)，此時(shí)將漂浮的囊泡狀細(xì)胞收集起來(lái)，加入Matrigel并放置在37℃條件下10min使Matrigel凝固。
12.?添加HM培養(yǎng)基并完全沒過Matrigel頂部，每3天更換培養(yǎng)基，每7天機(jī)械傳代一次類器官。
類器官擴(kuò)增和分化
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13.?將HM培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗后，加入EM培養(yǎng)基，放置在37℃，5%低氧的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天進(jìn)行類器官擴(kuò)增。
14.?隨后用DM培養(yǎng)基進(jìn)行換液，放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，完成進(jìn)一步分化。
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圖2. 擴(kuò)增培養(yǎng)基（EM）和分化培養(yǎng)基（DM）孵育后的肝類器官免疫熒光圖【2】
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肝類器官應(yīng)用前景
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類器官是一種能夠進(jìn)行體外更新和自組裝的模型，相比于傳統(tǒng)的二維(2D)細(xì)胞培養(yǎng)，類器官的生長(zhǎng)環(huán)境更貼合生理?xiàng)l件。3D培養(yǎng)的肝類器官可以用于疾病建模，以便確定疾病的機(jī)制以及治療方法。研究表明，3D培養(yǎng)的iPSC來(lái)源的肝類器官比2D干細(xì)胞更易感染乙型肝炎病毒【3】。2019年Ouchi, R.et al.【4】利用iPSCs來(lái)源的肝類器官，在體外模擬了炎癥和纖維化，為進(jìn)一步了解Wolman疾病打下了基礎(chǔ)。
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在藥物毒性驗(yàn)證方面，肝類器官同樣發(fā)揮著重要的作用。對(duì)乙酰氨基酚是藥物引起肝衰竭的最常見來(lái)源，利用肝臟類器官可以實(shí)現(xiàn)藥物的肝毒性驗(yàn)證，更適用于未來(lái)的藥物篩選和開發(fā)【5】。
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類器官作為一種研究模型，在發(fā)育生物學(xué)、疾病病理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、再生機(jī)制、精準(zhǔn)醫(yī)療以及藥物毒性和藥效試驗(yàn)等方面潛力巨大。但是，類器官培養(yǎng)技術(shù)建立過程中會(huì)面臨多種挑戰(zhàn)。為了更輕松更高效的建立類器官培養(yǎng)技術(shù)，歡迎各位掃碼加入類器官培養(yǎng)交流群，在這里會(huì)有專業(yè)的技術(shù)支持人員幫您解惑答疑，也將定期分享類器官前沿進(jìn)展，讓類器官培養(yǎng)更簡(jiǎn)單！
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類器官培養(yǎng)交流群
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推薦產(chǎn)品-肝類器官培養(yǎng)
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貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
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相關(guān)產(chǎn)品：
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參考文獻(xiàn)
【1】TAKEBE, Takanori, et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.?Nature protocols, 2014, 9.2: 396-409.
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【2】MUN, Seon Ju, et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.?Journal of hepatology, 2019, 71.5: 970-985.
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【3】Nie, Y. Z. et al.(2018). Recapitulation of hepatitis B virus–host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells.?EBioMedicine,?35, 114-123.
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【4】Ouchi, R.?et al. (2019). Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids.?Cell metabolism,?30(2), 374-384.
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【5】Sgodda, M.?et al.?(2017). A scalable approach for the generation of human pluripotent stem cell-derived hepatic organoids with sensitive hepatotoxicity features.?Stem cells and development,?26(20), 1490-1504.
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