漲知識(shí) | qPCR專場(chǎng)一：如何做好擴(kuò)增片段和引物設(shè)計(jì)？
熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種檢測(cè)方法。該方法通過(guò)在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來(lái)記錄DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對(duì)PCR過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的，并且可以通過(guò)數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量”中“定量”一詞的來(lái)源。
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熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實(shí)驗(yàn)，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生巔峰呢？
對(duì)于熒光定量PCR數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性而言，反應(yīng)效率至關(guān)重要。在理想狀態(tài)下，PCR反應(yīng)中對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)在每個(gè)循環(huán)中進(jìn)行復(fù)制，每個(gè)循環(huán)增加一倍的分子量，對(duì)應(yīng)的即為100%的擴(kuò)增效率。隨著循環(huán)數(shù)的增加，效率的變化或差異會(huì)被放大，因此，任何造成與100%效率的偏差都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。
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擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)技巧
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不少小伙伴在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，對(duì)于目的擴(kuò)增片段的要求沒(méi)有太多關(guān)注。然而目的片段對(duì)于做好熒光定量也十分重要。選擇較短且特異性高的目標(biāo)片段是一種減少效率偏差的方法。
在給定的時(shí)間周期內(nèi)擴(kuò)增100個(gè)pb的靶標(biāo)片段比擴(kuò)增1000bp的靶標(biāo)片段更能保證完全100%合成。因此，在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中80-200個(gè)bp能保證結(jié)果更加精準(zhǔn)。另外較短的靶標(biāo)片段受模板完整性變化的影響也相對(duì)較少,例如核酸樣本(RNA或cDNA)輕微降解且靶標(biāo)片段較長(zhǎng)，則上游引物和下游引物很難在同一DNA片段中找到其互補(bǔ)序列。
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靶標(biāo)序列的特異性是效率偏差的另一個(gè)重要因素，靶標(biāo)序列的特異性選擇可幫助引物的結(jié)合位點(diǎn)在基因組中是唯一的，從而降低引物在樣品基因組中其他區(qū)域擴(kuò)增類似序列的可能性。
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引物設(shè)計(jì)技巧
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引物設(shè)計(jì)的好壞，密切關(guān)乎著擴(kuò)增效率的高低、產(chǎn)物特異性的與否。所以正確設(shè)計(jì)出引物是qPCR成功的重要一步。
qPCR是特殊的PCR，所以，qPCR的引物設(shè)計(jì)要滿足一般PCR引物設(shè)計(jì)的原則，見(jiàn)下表。
*1 OLIGO Primer Analysis Software
*2 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
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其中qPCR引物設(shè)計(jì)需要著重關(guān)注以下幾點(diǎn)：
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01
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減少引物二聚體的發(fā)生
非特異性產(chǎn)物本身會(huì)和SYBR 染料結(jié)合導(dǎo)致熒光產(chǎn)生，從而人為地改變反應(yīng)的Ct值。非特異性擴(kuò)增可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)組分來(lái)影響反應(yīng)效率，從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性降低。引物二聚體是一類常見(jiàn)的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。引物二聚體通常是由正向和反向引物之間的相互作用引起的，但也可能是正向-正向或反向-反向引物退火的結(jié)果，或者單個(gè)引物自行折疊的結(jié)果。如果二聚化以交錯(cuò)的方式發(fā)生作用，則可能發(fā)生一些片段延伸，導(dǎo)致產(chǎn)物接近預(yù)期靶標(biāo)片段的大小，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。
02
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區(qū)分isoform
對(duì)于同一個(gè)基因名來(lái)說(shuō)，可能會(huì)有不同的isoform。isoform指的是，對(duì)于同一個(gè)基因，它的mRNA有多種不同剪接方式，這個(gè)時(shí)候表達(dá)出來(lái)的的蛋白可能會(huì)有不同，所以小伙伴們?cè)谠O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，一定要想清楚自己要做的是哪一個(gè)isoform。
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舉個(gè)“栗子”：比如說(shuō)一個(gè)基因有四種不同的isoform，如果大家想要檢測(cè)的是四種不同剪接方式轉(zhuǎn)錄本之和，那么設(shè)計(jì)引物時(shí)就要針對(duì)這四個(gè)isoform的共有序列設(shè)計(jì)。如果只想檢測(cè)其中一種isoform，那就要在這個(gè)isoform與其他三個(gè)isoform的不同序列位置設(shè)計(jì)引物。
03
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跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物
跨越內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物可以區(qū)分并且規(guī)避基因組DNA (gDNA)污染。gDNA可能與目的轉(zhuǎn)錄本共擴(kuò)增，產(chǎn)生無(wú)效的數(shù)據(jù)。在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中避免gDNA干擾的最佳方式是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊镌O(shè)計(jì)。
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引物設(shè)計(jì)的序列最好選擇相鄰的外顯子或一端或兩端引物跨越內(nèi)含子設(shè)計(jì)。當(dāng)上游和下游引物在同一外顯子內(nèi)發(fā)生退火時(shí)，其可擴(kuò)增DNA和RNA上對(duì)應(yīng)的序列。當(dāng)引物在相鄰?fù)怙@子中退火時(shí)，只有cDNA會(huì)被擴(kuò)增，因?yàn)榇藭r(shí)源自gDNA的擴(kuò)增片段會(huì)包括內(nèi)含子序列，導(dǎo)致擴(kuò)增子太長(zhǎng)，無(wú)法在熒光定量PCR的反應(yīng)條件下有效擴(kuò)增。
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以人基因組來(lái)說(shuō)，平均每個(gè)基因有8.8個(gè)外顯子和7.8個(gè)內(nèi)含子，80%的外顯子長(zhǎng)度小于200bp，少于10%的內(nèi)含子長(zhǎng)度在1100bp以上，不到0.01%的內(nèi)含子長(zhǎng)度小于20bp。例如外顯子長(zhǎng)度200bp，為了兼顧擴(kuò)增子長(zhǎng)度，我們可以把上游引物設(shè)置在外顯子1和外顯子2的中間，下游引物設(shè)置在外顯子2的位置。
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以上是引物設(shè)計(jì)需要注意的問(wèn)題，在初步設(shè)計(jì)好引物之后，我們需要在NCBI上進(jìn)行BLAST檢驗(yàn)，來(lái)確保產(chǎn)物的特異性。
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理論知識(shí)很豐富了，現(xiàn)在讓我們實(shí)戰(zhàn)一下吧！
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第一步
選擇靶基因
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打開(kāi)NCBI，選擇“Gene”，輸入想要檢測(cè)的基因名稱，我們以人基因“ALAD”為例。
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會(huì)出現(xiàn)很多搜索結(jié)果，我們選擇需要的種屬來(lái)源，即“human”，如果你知道Gene ID（每個(gè)基因有且只有一個(gè)特定的ID，類似于人的身份證），也可以根據(jù)Gene ID來(lái)選擇。這里我們選擇搜索結(jié)果中的第一個(gè)。
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點(diǎn)開(kāi)之后，會(huì)出現(xiàn)很長(zhǎng)的頁(yè)面，耐心往下拉，找到“mRNA and Protein（s）”欄下的NM編號(hào)，不同的NM編號(hào)，代表不同的isoform。選擇想要檢測(cè)的那一個(gè)。
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確定NM號(hào)點(diǎn)擊后，可以看到這個(gè)isoform的一些基本信息。
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例如：gene代表基因長(zhǎng)度3129bp，CDS代表編碼蛋白區(qū)域149-1141bp
以及此基因的序列，如下圖所示。此序列就是設(shè)計(jì)引物時(shí)對(duì)應(yīng)的模板。
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第二步
用軟件設(shè)計(jì)引物
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引物設(shè)計(jì)軟件有很多，例如oligo7、Primer5、Clone Manager等，以及很多在線網(wǎng)站，例如Primerbank （https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）、Primer3plus（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi） 、NCBI 的Primer BLAST等。在手頭沒(méi)有安裝合適的軟件的時(shí)候，我們可以選擇在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物。
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這里以延續(xù)第一步使用NCBI確定靶基因的步驟為例。了解完我們所需的isoform后，我們可以點(diǎn)擊右側(cè)的“Pick Primers”，就能直接進(jìn)入Primer-BLAST的頁(yè)面進(jìn)行引物設(shè)計(jì)了。
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在彈出來(lái)的界面里粘貼模板序列或者輸入基因序列號(hào)。另外需要設(shè)置“上下游引物位置”和“擴(kuò)增子長(zhǎng)度”。最主要的設(shè)置就是這兩點(diǎn)了，另外還有“物種名稱”、“數(shù)據(jù)庫(kù)”等其他選項(xiàng)可以設(shè)置。
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設(shè)置好之后，點(diǎn)擊頁(yè)面左下角的“Get Primers”。
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彈出如下界面，點(diǎn)擊“Check”
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多對(duì)引物，選擇合適的引物即可。
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第三步
引物特異性驗(yàn)證與確認(rèn)
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以第二步中使用的Primer-BLAST為例，輸入設(shè)計(jì)好的上下游引物，其他參數(shù)不做調(diào)整改動(dòng)，提交后即可看到輸入的引物是否在其他基因上也存在，若全部顯示在目標(biāo)擴(kuò)增的基因中，說(shuō)明引物的特異性達(dá)標(biāo)。
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以上是對(duì)qPCR擴(kuò)增片段和引物設(shè)計(jì)的介紹，相信小伙伴們通過(guò)小翌的介紹，對(duì)如何設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段和引物已經(jīng)有一定的了解啦。關(guān)于如何做好qPCR實(shí)驗(yàn)，小翌會(huì)陸續(xù)在公眾號(hào)里傳授秘籍噠，敬請(qǐng)期待哦。
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