過去十年來，新陳代謝的綜合研究取得了長足的進步。質譜技術（MS）通過同時測量多種代謝物發揮了核心作用。通過穩定同位素示蹤技術追蹤代謝物標記，還可以揭示代謝途徑的活動。
2018年，普林斯頓大學 Joshua D. Rabinowitz 課題組在國際頂級期刊《Cell》上發表了題為“Metabolomics and Isotope Tracing”的論文。在該文章中，研究人員描述了質譜技術對代謝物測量的基本原理，包括樣品準備、代謝組學分析和數據解釋。此外，通過成功實驗的例子，強調了代謝組學和同位素示蹤在揭示生物學方面的方式。
背景
然而，通過代謝組學測量代謝物濃度只能說明一半的問題。同樣重要的是理解代謝途徑的活動，這可以用單位時間內的物質流量來量化，即代謝通量。濃度和通量并不總是可靠地一致。在代謝中，代謝物的積累不僅可能是由于產生增加，還可能是由于消耗減少。例如，當從酵母中去除葡萄糖時，糖酵解流出急劇下降，導致較低的糖酵解中間產物的積累，盡管途徑流入減少。由于代謝物水平和通量提供了互補的信息，因此通過研究兩者可以更好地了解代謝。
與代謝物不同，通量不是可以在質譜儀中測量的物理實體。然而，可以通過同位素示蹤來推斷通量。經典的放射性示蹤劑研究為現代對新陳代謝的理解奠定了基礎。今天，類似的研究可以使用質譜或核磁共振來廣泛而定量地追蹤非放射性穩定同位素示蹤劑的命運。為了在系統層面量化通量，需要使用計算模型將大量示蹤數據集成起來。但即使沒有這樣的計算，通過對同位素示蹤實驗的直觀解釋仍然可以獲得有價值的生物學洞察力。此外，直觀解釋通常可以通過使用方程來量化關鍵通量或通量比來進行補充。這樣的定向同位素示蹤方法與代謝組學一起在這里進行介紹。一、代謝組
代謝物由一系列耦合的酶反應網絡產生和消耗，將輸入的營養轉化為可用的能量和生物質。在穩態下，每種代謝物的定量流入和流出必須平衡。代謝網絡的規模因生物體而異，從大約500個到幾千個反應和水溶性代謝物不等。這些代謝物的結構在從細菌到人類的各個生物中基本相同。這反映了所有生物體都需要核苷酸、氨基酸和脂肪酸來合成DNA/RNA、蛋白質和細胞膜的事實。幾乎所有生物都合成或消耗葡萄糖，而纖維素是地球上最豐富的生物高分子。因此，大約有100種高通量化合物始終是主要的代謝組分：氨基酸、核苷酸以及糖酵解、磷酸戊糖途徑（PPP）和三羧酸循環的中間產物。
與代謝的有限核心相比，生物系統中的小分子的完整范圍是龐大的。它包括其他功能重要的代謝產物：酶的激活劑和抑制劑；大分子修飾的供體和調節體；信號分子，包括神經遞質和激素；物種間戰爭的介質，如抗生素；以及結構和能量儲存分子，如脂質。由于脂質非常豐富且其性質與水溶性代謝物不同，脂質的測量形成了自己的“組學”領域（脂質組學）。除了內源代謝物外，食物鏈中較高層次的生物體還包含其他物種制造的次生代謝產物。人體樣本通常還含有藥物、人工香料和其他外源物質及其代謝副產物。
除了已知的代謝產物之外，對未知代謝組的研究引起了極大的興趣。盡管基因組測序可以揭示生物體中的所有基因和蛋白質，但由于未知蛋白質的催化潛力、酶的多功能性以及來自食物的代謝輸入的多樣性，代謝產物的完整集合仍然難以定義。觀察到基于質譜的代謝組學研究中大多數峰值仍未被鑒定，增加了對未知代謝組的興趣，盡管這些峰值中的許多是分析假象。然而，新的代謝產物和反應肯定還有待發現。
二、代謝組學
代謝組學，無論是否涉及同位素示蹤，包括三個基本步驟：（1）樣品準備，（2）代謝組測量，以及（3）數據分析。
(1)樣品制備
在代謝組學中取得成功始于選擇合適的實驗。在這方面，希望讀者能受到下文描述的一些生物應用以及下面表格的啟發，該表突顯了許多不同的同位素示蹤劑及其實用性。在本節中，專注于代謝組學研究中的基本設計問題，這些問題適用于許多應用領域。
對營養環境的控制尤為重要。對于體內研究，這意味著需要密切關注飲食、禁食和飲食組成。對于細胞培養研究，這意味著要特別注意培養基的選擇和培養基更換的時機。通常情況下，化學成分確定的培養基通常優于復雜的生物培養基，如溶源肉湯 (LB)。對于哺乳動物細胞培養，使用市售的透析胎牛血清可以避免血清代謝物造成的混淆。
對于同位素示蹤研究，通常最好在引入示蹤劑時避免代謝擾動，即保持“代謝穩態”。這可以通過將特定的養分從未標記形式更改為標記形式，切換到其他方面相同的培養基來實現。標記的持續時間取決于感興趣的代謝途徑以及是追求動態數據還是穩態數據。在培養細胞中，通過大約10分鐘實現糖酵解的穩態標記（即“同位素穩態”），而通過大約2小時實現三羧酸循環的穩態標記，核苷酸的標記需要大約24小時。需要非常迅速的采樣來捕捉糖酵解標記的動態過程（例如，10秒的時間尺度），而可以通過在15、30、60和120分鐘等時間點進行采樣來探測三羧酸循環的動態過程。進行為期一天的實驗通常便于收集穩態標記數據。
另一個關鍵問題是收集代謝產物。對于細胞和組織來說，這是一個特殊的挑戰，因為許多重要的代謝產物在幾秒內就會自然周轉。因此，獲得準確的代謝物譜需要幾乎立即停止代謝活動。這仍然是一個積極研究的領域。典型的方法包括冷凍和/或酶變性。已經報道了各種提取和滅活的方案。對于培養細胞，一個簡單的方法是在去除培養基后立即通過抽吸（對于附著細胞）或快速過濾（對于非附著細胞）添加冷有機溶劑。低溫會迅速減慢新陳代謝，有機溶劑會使酶永久變性。最好避免可能改變代謝的操縱，比如在滅活代謝之前沉淀或洗滌細胞。
對于組織標本，最實際的方法是先冷凍，然后提取。通過在液氮溫度金屬板之間粉碎組織，可以實現快速冷凍，這一技術被稱為Wollenberger夾具。由于傳熱效果更好，這比直接將組織碎片放入液氮中要快得多。然后，可以將組織存儲在-80°C，通過研磨粉碎，然后用冷有機溶劑提取。在采樣之前和期間必須小心避免代謝的改變。這并不簡單，因為麻醉或安樂死都可能引起代謝變化。事實上，即使是實驗者（或醫生）的視線也可能引發改變新陳代謝的壓力反應。
另一個復雜因素是有機溶劑可能無法立即停止酶活性。持久的催化活性對于高能化合物如NADPH和ATP是一個特殊問題。這些豐富代謝產物的降解產物本身是生物學上重要的代謝產物，即使NADPH的輕微降解也會顯著增加NADP，而ATP的顯著降解也會增加ADP和AMP。對于對這些化合物感興趣的生物學家，建議使用有機溶劑和酸的組合進行提取，因為酸可以加速酶的變性。具體而言，發現40:40:20乙腈：甲醇：水與0.1 M甲酸的混合物，然后在幾分鐘后加入碳酸氫鹽以中和樣品，能有效地捕獲這些代謝產物。未來可能會有更好的方法進行進一步的研究。
代謝組學采樣的固有挑戰使得驗證性測量變得尤為重要。例如，特定的基因擾動是否會在從麻醉和安樂死的小鼠的肝臟中采樣時產生相同的代謝變化？另外，某些代謝產物可以直接在體內測量，例如使用熒光報告基因。與此同時，重要的是要認識到即使是不完美的樣本收集也可能提供有價值的見解。在臨床研究中，組織采樣通常會發生一些延遲，但這是對人類數據益處的合理權衡。
（2）質譜分析
拿到提取物后，面臨的挑戰是盡可能準確地測量盡可能多的代謝物。在代謝組學的早期階段，常用一維質子核磁共振（NMR）來生成代謝組圖譜。雖然峰可以被指定給功能團，但大多數峰反映了來自多個代謝物的集成信號。通過多維NMR，這些局限性已經得到部分解決，而且由于其結構闡明、體內代謝物測量和通用檢測的能力（幾乎每個代謝物都包含質子，因此產生質子NMR信號），NMR仍然在代謝組學中發揮著重要作用。然而，由于質譜具有無與倫比的能力，可以檢測低豐度代謝物而不受與之相近物種的干擾，研究者們越來越多地依賴質譜。
這反映了現代質譜儀卓越的分辨率和靈敏度。在質譜中，分辨率被定義為m/Δm的比率，其中m是分析物的質量，Δm是可以區分的最小質量差異。實現高分辨率允許獨立測量質量差異較小的代謝物。例如，肌酸（C4H9N3O2）和亮氨酸（C6H13NO2），在正離子模式下的精確質荷比分別為132.076和132.102，可以在4000分辨率下區分。對于同位素示蹤，高分辨率可以區分用不同重核標記的物種。例如，帶有一個2H和一個13C的M+1棕櫚酸酯同位素異構體可以在100,000質荷比分辨率下分離。
要被質譜檢測，液體提取物必須被電離。這通常是通過電噴霧電離實現的：在液體從針尖流出時施加高電壓，將液體轉化為最終生成氣相離子的微小帶電液滴。
電噴霧電離是一種相對“溫和”的電離過程，通常產生完整的（去）質子化代謝物離子，在正離子模式下為（M+H）+，在負離子模式下為（M-H）−。然而，它還會生成多種加合物（例如[M+Na] +）和碎片，這使得所得的質譜和下游數據分析變得復雜。
在代謝組學中常用的質譜儀有飛行時間質譜儀（TOF）、軌道阱和四極桿。這三者都在電場中操控離子。TOF儀器使離子在一根飛行管中競速。首先，通過電壓降（ΔV）加速離子以賦予其動能。然后，離子的速度取決于其質荷比（m/z），質荷比較低的離子在飛行管中飛行得更快。當前的TOF儀器通常具有10,000至60,000的質荷比分辨率。Orbitrap 儀器監測紡錘形電極上下的離子振蕩。離子被注入軌道阱并繞主軸旋轉，靜電引力通過向心力平衡。由于紡錘體的形狀，離子也會沿著其長軸振蕩，這些 z 軸振蕩的頻率僅取決于離子 m/z。這些振蕩的頻率可用于確定 m/z，分辨率超過 100,000，甚至高達 1,000,000。盡管成本較高，但離子回旋共振儀器可以實現更高的分辨率，其中循環離子運動是由強磁場引起的。
與TOF和orbitrap等高分辨率質譜儀不同，四極桿充當低分辨率質量過濾器，過濾掉除了特定感興趣的m/z以外的所有離子（±0.5 dalton）。四極桿通常放置在高分辨率質譜儀的前面，以制成混合質譜儀，如四極飛行時間（Q-TOF）。這使得能夠分離特定質量的離子，然后進行碎片化（通過與惰性氣體碰撞）并對碎片離子進行高分辨率分析。由此產生的串聯質譜（MS/MS）譜反映了母離子的結構，并可用于代謝物的鑒定。或者，四極桿可以在沒有高分辨率質譜儀的情況下串聯放置，制成三重四極桿儀器。三重四極桿儀只測量預定義的目標離子子集，但對于測量單一分析物提供了最佳靈敏度。
（3）色譜法
通過在質譜測量之前在柱上物理分離分析物，色譜法增強了代謝組學的覆蓋范圍，并提高了質譜的定量準確性。色譜法尤為重要，因為電噴霧電離過程具有競爭性質；豐富的離子會抑制共離子化物質的信號。色譜分離減少了離子抑制，改善了對低豐度物種的檢測。它還可以防止定量偽影，其中豐度物種濃度的變化系統地改變了其他共離子化代謝物的信號強度。
色譜法的另一個優點是異構體的分離，異構體是具有相同分子式但不同結構的化合物，例如亮氨酸和異亮氨酸。異構體在新陳代謝中很常見。例如，磷酸己糖有十多種異構體，每種異構體都有不同的生物學作用。通過簡單的 MS 無法區分異構體，但可以通過色譜法和/或 MS/MS 碎片模式來區分。
色譜法對于區分真實代謝產物信號和在電離步驟中由于高電離能而導致的代謝產物碎裂引起的偽信號也至關重要，這時一些代謝產物可能分解成與其他代謝產物具有相同m/z的碎片。例如，檸檬酸的碎片模擬了四種不同的羧酸代謝產物。ATP的碎片模擬ADP和AMP。因此，盡管沒有色譜法的直接質譜分析可以以高通量檢測大量離子，但它容易受到許多假陽性和假陰性的影響。
色譜法和質譜通常被耦合在一起，例如氣相色譜-質譜（GC-MS）或液相色譜-質譜（LC-MS）。氣相色譜要求分析物蒸發，并根據它們在氣相（“流動相”）和色譜柱內的液層（“固定相”）之間的分配進行分離。它最常與質譜耦合，采用電子電離作為硬電離技術，產生一組特征性的碎片代替完整的代謝物離子。可以通過保留時間并將碎片模式與光譜庫進行匹配來識別峰。相對于液相色譜，氣相色譜具有更優越的色譜分辨率，尤其適用于測量低分子量（例如乙酸）、高揮發性（例如醇類）或電噴霧電離下離子化較差的分析物（例如甾醇）。通過化學衍生，它還可以測量中等大小的帶電代謝物，如糖單磷酸。
液相色譜通過在柱內填充的溶劑和微米級珠子之間的分配對代謝物進行分離。反相（RP）色譜法涉及疏水小珠（通常為C18）和使用從水到有機溶劑的梯度洗脫。它適用于許多極性代謝物和脂質，但不能保留親水性代謝物，如氨基酸。對于含有多個磷酸基團的代謝物，如ATP，它也產生較差的峰形。這些不足可以通過向運行緩沖液中添加適度疏水的陽離子，如三乙胺，來進行校正，它充當離子配對劑，有助于將陰離子代謝物結合到色譜柱上。然而，陽離子配對劑在正模式下會導致嚴重的離子抑制，并且需要數周才能從LC系統中清除；因此，需要一個專用于負模式分析的系統。
親水相互作用色譜（HILIC）涉及親水性小珠，以及從有機溶劑到水的梯度洗脫。在過去的十年中，HILIC方法取得了顯著的進展，允許在同一儀器上進行正模式和負模式的分析。有多種HILIC柱的化學成分可供選擇。在這些中，發現酰胺樹脂對于測量核心代謝組特別有效。另一種適用于測量核心代謝組的液相分離方法是毛細管電泳，其中分離基于通過液體的差異電壓驅動而非柱上相互作用。
（4）數據處理
數據分析的第一步是將原始質譜數據轉換成一個帶有峰標識和樣本間強度的注釋表。這涉及到計算算法，用于選擇峰，使它們在樣本間對齊，并量化峰的強度。在典型的液相色譜-質譜（LC-MS）運行中，大多數>10,000個峰都反映了環境污染物、加合物或源內碎片，而不是代謝物分子離子，可以忽略不計。有趣的峰可歸為兩類：（1）它們對應于已知代謝產物；（2）它們在不同的生物條件下有顯著差異。
鑒于一種經過良好注釋的色譜法，可以基于準確的質量和保留時間識別已知代謝產物。開源軟件Maven（現在維護為 ElMaven）專門設計用于提取已知代謝產物峰的強度和標記模式。在具有準確的色譜保留時間庫（使用代謝產物標準測量）的情況下，Maven或相關的商業軟件可以輕松查看原始離子特異色譜圖，并將這些原始數據流程化為已知代謝產物信號強度的表格。
為了找到不同生物條件下的峰，廣泛使用開源程序XCMS。它可以識別顯著變化并有助于搜索 MS/MS 譜圖匹配。XCMS 還可以通過基于網絡的平臺在線訪問。可以通過匹配已知標準品的保留時間和/或碎片模式來識別峰。通過MS/MS測量的碎裂圖譜在儀器之間相當一致可以通過搜索 MS/MS 譜數據庫（例如 HMDB、METLIN）來識別代謝物。當沒有找到MS/MS匹配時，MS/MS仍然可以提供關于未知化合物中存在的官能團的線索。然而，對于小分子結構的闡明，核磁共振（NMR）仍然是黃金標準。
（5）解釋
解釋代謝組學數據的起點是理解信號強度和濃度之間的關系。在質譜中，對于任何給定的分析物，信號強度（以離子計數測量）通常與濃度呈線性關系。因此，可以基于離子計數的倍增變化推斷相對量。然而，不同化合物的響應因子（例如電離效率）差異很大。因此，絕對定量需要與標準品比較。最好的方法是在淬火時添加同位素內標。由于許多代謝物并沒有同位素標準品，因此有時標記生物樣品更容易（例如，通過在[U-13C]葡萄糖中培養細胞）。一旦對參考條件的絕對代謝物水平有所了解，就可以通過相對定量確定其他條件中的絕對水平。以濃度為考量，而不是任意的信號強度，有助于將研究結果置于情境中。例如，當在特定條件下代謝物上升時，它是否影響滲透壓？或者它仍然只存在微量？濃度如何與消耗酶的Km值相關？
可視化代謝組學數據集中濃度變化的整體模式的一個好方法是使用聚類熱圖，可以使用免費開源工具生成（例如Cluster 3.0和Java Treeview）。樣品中顯示相似模式的代謝物組合在一起，如樹狀圖（樹形圖）中所反映的那樣。
熱圖也可以用于將顯示相似代謝響應的樣本分組在一起。評估樣本之間的整體相似性或差異的一種更精細的方法是主成分分析，它可以識別最能區分樣品的代謝物的線性組合。沿著前兩個主要成分繪制樣品的位置，以圖形方式突出顯示哪些樣品具有相似的代謝物特征。此類圖可以通過 MetaboAnalyst等免費軟件生成。
數據分析的另一個方面是查找在不同條件下顯著變化的代謝物（或標記模式）。這可以使用標準統計檢驗來完成。由于代謝組學研究測量許多代謝物，因此僅憑偶然性（平均為 100 中的 5），預計某些代謝物的 p 值將 < 0.05。為了降低錯誤發現率，應使用 Benjamini-Hochberg 過程調整 p 值。錯誤發現糾正后的重要發現可以在條形圖中突出顯示。
對于同位素示蹤，可視化標記模式的一種便捷方法是堆疊條形圖，其中每種顏色代表特定的標記形式。在分析標記數據之前，校正天然同位素豐度非常重要。最大的貢獻者是 1.1% 的天然碳 13 豐度，但最好校正所有相關的天然同位素，同時考慮到所使用的示蹤劑和質譜儀的分辨率。為此目的而存在軟件。標記分數為標記形式的絕對量值提供補充信息。
在查看了聚類熱圖并逐個檢查變化的代謝物后，數據中的關鍵信息通常開始浮現。為了促使這一過程，通常通過檢查其結構、使用類似KEGG或MetaCyc的通路數據庫檢查其產生和消耗途徑，并通過Google或PubMed搜索已知的生物學關聯，來“了解”顯示出有趣濃度或標記變化的不熟悉的代謝物。還開發了軟件，以幫助基于在特定實驗中顯示出水平改變的通路代謝物的比例來識別受影響的通路。
三、生物應用
在這里，重點介紹代謝組學和同位素示蹤可以闡明生物學的四種一般方式。 在每種情況下，都會討論選定的成功實驗。目標不是回顧代謝組學和同位素追蹤的貢獻，而是討論一小部分實驗，以激發新用戶的興趣。
a、尋找特定的代謝物
代謝組學最強大的應用之一是尋找具有特定生物學作用的代謝物。一個簡單的情況涉及識別酶的底物。對于新的或非特異的酶，生理底物在生物化學上可能難以識別。現在有許多成功利用代謝組學進行這一目的的例子。典型的實驗設計涉及敲除酶并尋找代謝組的變化。在大多數情況下，酶敲除導致生理底物的積累，而 XCMS 等軟件可以有效地從非目標 MS 數據中提取這些峰。
代謝組學還可以識別意想不到的酶產物。一個特別重要的案例涉及導致人類癌癥的 TCA 循環酶異檸檬酸脫氫酶（IDH1 和 IDH2）的活性位點突變體。雖然最初的生物化學提示這些突變酶是無活性的，但代謝組學分析顯示，表達致癌突變 IDH 的細胞具有正常量的酶的典型底物和產物，但三個意外的 LC-MS 峰急劇增加。這三個峰都在單一保留時間點發生，表明它們都起源于單一代謝物。其中一個峰被證明是突變酶產生的代謝錯誤產物 2-羥基戊二酸的分子陰離子。另外另外兩種是鈉加合物和源內脫水產物。隨后的研究表明，2-羥基戊二酸通過抑制組蛋白和 DNA 去甲基化而導致癌癥。
代謝組學還可以用于識別與更復雜生物學功能相關的代謝物。一種方法是從引發感興趣的生物反應的提取物開始。可以使用大小過濾、有機萃取或熱處理來確定活性是否存在于小分子或大分子（例如蛋白質）中。當活性存在于小分子中時，代謝組學可以識別其中存在的物質。然后可以將提取物純化成級分，尋找與生物活性一致的MS（或NMR）峰。這種方法成功地識別了氨基酸纈氨酸的代謝產物3-羥基異丁酸，作為跨血管內皮細胞脂肪運輸的誘導劑。
也許最大的興趣在于識別與常見人類疾病相關的代謝物，以用作診斷或預后標志物。代謝物在發揮這種作用方面的潛力已經得到充分驗證，葡萄糖和膽固醇的測量在現代醫學中至關重要。重要的是，葡萄糖和膽固醇濃度的輕微變化（例如50%）被用于指導診斷和治療。為了通過代謝組學找到類似的生物標志物，需要大樣本量。為了減少選擇峰和假發現的統計機會，迄今為止，人類常見疾病最成功的代謝組學研究都集中在已知的代謝物上。例如，為了發現能夠預測2型糖尿病發展的代謝物，通過 LC-MS 對 Framingham 后代研究中跟蹤 12 年的 2,422 名個體樣本進行了分析，重點使用三重四極桿 MS 分析核心代謝組。這揭示了支鏈氨基酸（BCAA：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）濃度的適度增加（30%）預測未來胰島素抵抗。由于在這種基于人群的人類研究中很難證明因果關系，因此在小鼠模型中尋找相同的表型是有價值的。事實上，在標準小鼠糖尿病模型中很早就發現了支鏈氨基酸升高。這些模型現在被用來確定支鏈氨基酸升高的機制以及這種升高如何影響發病機制。總的來說，這些研究強調了代謝組學在尋找具有特殊生物學重要性的代謝物方面的效用，包括癌癥和糖尿病這兩種最常見疾病的新驅動因素。
b、縱觀全局
除了發現特殊重要性的代謝物之外，代謝組學的一個關鍵優勢是全局視角。在許多情況下，通過看到多個相關代謝物同時變化來增加信心。顯著的例子包括糖尿病患者中所有三種支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）水平升高，以及自閉癥患者中三種不同的煙酰胺相關代謝物水平升高。同樣，雖然各種乙酰化亞精胺種類先前已被認為與癌癥有關，但在這些代謝物在多項代謝組學研究中成為最強的癌癥預測因子后，人們對這些代謝物作為生物標志物的興趣大大增加。
除了將特定的代謝變化置于背景中之外，代謝組學還可以揭示一般的生物學原理。 例如，微生物的多項代謝組學研究支持這樣的概念：代謝對遺傳變化相對穩健，但對營養環境敏感。在大腸桿菌和酵母中，酶的單次敲除對整體代謝組影響不大，主要是代謝物直接在被消除的酶上游積累。轉錄因子和信號蛋白的敲除突變體在代謝組中表現出更弱但更廣泛的變化，這些變化相對微妙，但反映了基因的功能。相反，營養環境的變化導致代謝物濃度的大規模全局變化。為什么中心代謝酶的敲除通常只產生局部代謝變化，而養分匱乏產生全局代謝變化？代謝網絡包含多個部分冗余的途徑，可以繞過許多堵塞。但元素營養素是無可替代的。更一般地說，由于底物可用性對通量的強烈影響，代謝與營養環境密切相關。對養分限制的強烈代謝物變化可能具有多種好處：提供養分條件的穩健胞內信號；在艱難的養分環境中優化生存和生長；并在養分條件改善時為細胞迅速恢復做好準備
代謝組學還可以與其他組學方法相結合。這些努力的一個重要目標是了解不同生物分子類別的調控相互作用。這通常通過動態測量來促進。例如，對擬南芥植物對光/暗循環的反應進行的一系列代謝組學和轉錄組學測量發現，黑暗會快速誘導蛋白質降解基因。隨后氨基酸水平增加。氨基酸水平的增加反過來觸發氨基酸生物合成基因的下調。這種“組學驅動的假設”的產生是有價值的，最終的證據在于檢驗因果關系的驗證性基因實驗。
c、追蹤代謝路徑
代謝組學測量代謝產物的豐度。雖然提供信息，但代謝物豐度并不能揭示途徑活性：代謝物水平由生產和消耗的平衡以非線性方式決定。代謝水平增加可能是由于生產速度加快或消耗速度減慢所致。區分這兩種選擇通常是至關重要的。例如，當代謝產物在疾病狀態下的產生增強時，抑制該途徑是合理的。因此，使用同位素示蹤探測途徑通量具有很大的價值。
這可以通過引入同位素示蹤劑并測量下游代謝物標記的動態來實現。直觀地說，更快的標記意味著更高的通量。實際上，對于直接由示蹤劑制成的代謝產物，標記累積的初始速率（以摩爾濃度或每個細胞的摩爾數來測量，而不是標記分數）等于反應的通量。對于此類代謝物，假設代謝穩態，通量也可以根據標記半衰期和代謝產物池的大小計算：通量 = ln 2 × 池大小 / t1/2。然而，對于更下游的代謝產物，標記動態取決于示蹤劑和測量分析物之間所有代謝物的通量和池大小。例如，糖酵解和PPP通常以相似的速率標記，反映了葡萄糖-6-磷酸的標記，盡管糖酵解具有更高的通量。
另一種方法涉及確定同位素穩態下的標記模式。這樣的實驗有利于避免在許多不同時間點進行測量的需要。例如，為了評估相對于糖酵解的PPP通量，使用位置標記葡萄糖的穩態標記比使用 [U-13C]-葡萄糖的動態標記更有效。一種有效的示蹤劑是選擇性在碳1和2上標記的葡萄糖（[1,2-13C]葡萄糖）。該示蹤劑通過氧化 PPP（而非糖酵解）進行分解代謝，可產生 M+1 標記的糖酵解代謝物。由于自然同位素M+1信號相當大，因此對自然同位素豐度進行正確校正至關重要。此外，將標記模式與途徑活動精確關聯非常重要。例如，[1,2-13C]葡萄糖特異性地探測氧化性 PPP 產生的 5-磷酸核糖通過非氧化性 PPP 回到糖酵解的通量。如果核糖用于核苷酸合成（如增殖細胞中發生的那樣），則糖酵解中不存在 M+1 特征。下表提供了用于解釋生成的標記模式的跟蹤器和啟發式列表。它包括簡單且廣泛使用的方法，例如均勻添加 13C 標記的營養物質并確定它們對 TCA 中間體的相對貢獻，以及使用位置標記示蹤劑探測特定通量的巧妙方法。隨著通量分析領域的成熟，希望這種啟發式方法將得到越來越好的驗證和廣泛使用。
目前，仔細思考代謝途徑中涉及的原子轉化以及它們與觀察到的同位素標記模式的關系仍然非常有價值。這種分析可以識別具有生物學意義的意外通量。一個重要的例子涉及在喂食[U-13C]谷氨酰胺的哺乳動物細胞中對檸檬酸鹽進行M+5標記。谷氨酰胺代謝的標準代謝途徑涉及其轉化為α-酮戊二酸，隨后在TCA循環中進行α-酮戊二酸的氧化代謝，產生M+4檸檬酸。相反，α-酮戊二酸的還原羧化產生 M+5 檸檬酸。通過使用選擇性在其第一個碳上標記的谷氨酰胺（[1-13C] 谷氨酰胺）進行追蹤，并最終通過 IDH1 敲除后顯示 M+5 檸檬酸鹽的損失得到了嚴格證明。隨著這些努力更完整地繪制新陳代謝的功能能力，同位素示蹤將變得更加適用于更廣泛的生物學社區。
d、多細胞生物的示蹤
在通量分析中，最前沿的是追蹤活體動物。從生物化學的一開始，同位素示蹤劑就被用于植物和動物——但現在借助代謝組學的力量，此類研究正在被重新審視。與細胞培養研究或孤立微生物研究相比，解釋更為復雜，因為任何給定組織中的標記不僅反映了其組成細胞的平均標記，還反映了示蹤劑的藥代動力學，即示蹤劑及其代謝產物的循環水平。
為了應對這種復雜性，一些相對簡單的計算是有價值的。對于動物研究，一個關鍵變量是同位素示蹤劑輸注速率。可以根據對循環營養物的內源產生和消耗速率的了解來確定實現特定目標富集在循環中所需的示蹤劑輸注速率，在穩定狀態下，這些速率必須平衡并被稱為營養素的循環周轉通量：Fcirc = R(1 – L)/L，其中R是輸注速率，L是血漿代謝產物的標記。通常最好實現在10%–30%的富集范圍內，以盡量減小對循環代謝產物水平的干擾，同時有足夠的示蹤劑以觀察下游產物的標記。
另一個有用的測量是血液中循環營養物對下游組織代謝產物水平的分數貢獻。例如，谷氨酰胺對TCA循環的貢獻有多大？這可以通過注入標記的谷氨酰胺直到組織標記達到穩態來探究。要估計谷氨酰胺的TCA貢獻，最簡單的方法是將組織TCA中間產物的標記除以血清谷氨酰胺的標記。當營養物質主要在組織內分解代謝時，這種方法效果很好。對于谷氨酰胺而言，盡管在培養的癌細胞中它對TCA循環的貢獻最大，但在體內的腫瘤中，它是次要的貢獻者。當輸入的營養物也可以通過轉化為另一種循環代謝產物間接供給組織時，就需要采用更復雜的方法。為了確定不同營養物的直接貢獻，需要對所有感興趣的循環營養物進行示蹤實驗（例如，葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺）。通過了解每個示蹤劑對每種循環營養物的標記以及組織標記數據，然后可以通過簡單的矩陣計算確定每種營養物的直接貢獻。使用這種方法，發現從輸入的葡萄糖中的TCA標記主要通過循環的乳酸進行：某些細胞將葡萄糖分解為乳酸，將其分泌到循環中，并用作大多數組織甚至腫瘤的主要TCA底物。通過這種方式，糖酵解和TCA循環在各個組織中解耦，實現了它們的獨立組織特異性調節。因此，動物中的示蹤可以揭示生物體代謝的新設計原則。
四、未來發展方向
代謝組學的一個重要方向是分析程序的標準化。 這解決了幾個需求。首先，雖然分析的各個步驟并不是特別復雜，但構建有效的集成工作流程仍然很棘手。其次，需要色譜標準化，以實現跨實驗室的峰身份有效共享。經過嚴格審查的精確質量和保留時間的文庫最終應該能夠實現已知代謝物的自動定量。標準化程序還應包括將帶注釋的數據表（包括測量的質量、保留時間和單個樣品峰值強度）發布到公共存儲庫。隨著儀器的不斷改進、實驗方案的標準化以及數據分析和共享的自動化，代謝組學有望在未來十年內為生物學家提供越來越廣泛的應用和幫助。
前沿方向是什么？一個迫切的需求是更好地理解代謝物的范圍。許多實驗室現在常規測量的約200種水溶性代謝物與LC-MS運行中發現的約10,000個峰之間存在巨大的差距。這種差距的大部分是由于個別代謝物產生許多不同的離子，這是由于成分形成和源內碎裂導致的。然而，在考慮了這些現象之后，未知的代謝物可能仍然多于已識別的代謝物。
Products of Interest
Catalog No. Description
CLM-420
D-Glucose (1-13C, 98-99%)
CLM-746
D-Glucose (2-13C, 99%)
CLM-504
D-Glucose (1,2-13C2, 99%)
CLM-2717
D-Glucose (1-13C, 99%; 6-13C, 97%+)
CLM-6750
D-Glucose (3,4-13C2, 99%)
CLM-4673
D-Glucose (1,2,3-13C3, 99%)
CLM-1396
D-Glucose (13C6, 99%)
DLM-349
D-Glucose (6,6-D2, 99%)
DLM-2062
D-Glucose (1,2,3,4,5,6,6-D7, 97-98%)
CDLM-3813
D-Glucose (13C6, 99%; 1,2,3,4,5,6,6-D7, 97-98%)
CLM-1579
Sodium L-lactate (13C3, 98%) 20% w/w in H2O
CLM-1578
Sodium L-lactate (3-13C3, 98%) 20% w/w in H2O
CLM-3612
L-Glutamine (1-13C, 99%)
CLM-1822-H
L-Glutamine (13C5, 99%)
NLM-1016
L-Glutamine (α- 15N, 98%)
NLM-557
L-Glutamine (amide-15N, 98%+)
NLM-1328
L-Glutamine (15N2, 98%)
CNLM-1275-H
L-Glutamine (13C5, 99%; 15N2, 99%)