編者按
腸道菌群是近年來中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點，不僅與中醫(yī)理論相契合，而且是中藥口服發(fā)揮藥效的重要靶點之一。基于腸道菌群的中藥藥理研究近年來也陸續(xù)刊登于核心期刊。
為了幫助廣大研究者了解中醫(yī)藥相關(guān)腸道微生物的研究進展與方法，我們收集整理了近幾年基于中藥及腸靶軸研究的發(fā)表于GUT、Nature Communications、Theranostics等高水平期刊的論文。
【中醫(yī)藥與腸道菌群專輯】為大家精細解讀重磅研究與進展。
【文獻名稱】Ginseng polysaccharides alter the gut microbiota and kynurenine/tryptophan ratio, potentiating the antitumour effect of antiprogrammed cell death 1/ programmed cell death ligand 1 (anti-PD-1/PD-L1) immunotherapy
【雜志名】：GUT
【影響因子】：IF=19.819
【中藥】：人參
【疾病】：非小細胞肺癌
【樣本類型】：C57 BL / 6J小鼠負荷Lewis肺癌細胞（LLC）模型、臨床患者
【技術(shù)方法】：靶向代謝組（SCFAs、氨基酸、脂肪酸）；16S PicBio SMRT測序；轉(zhuǎn)錄組
【關(guān)鍵菌群】：Muribaculum，Bacteroides（B. vulgatus，P. distasonis）
【是否菌群驗證】：是（糞便移植）
研究背景
【中藥背景】人參作為藥物或膳食補充劑在亞洲被廣泛使用。長期服用人參提取物能調(diào)節(jié)大鼠腸道Bifidobacterium, Allobaculum, Lactobacillus, Clostridium等菌群豐度，人參提取物能增加糞腸球菌的豐度，提高肉豆蔻酸的含量進而達到抗肥胖的作用。人參含有許多活性成分，包括人參皂甙、精油、肽聚糖、多糖等。已有研究表明人參多糖（GPs）具有免疫調(diào)節(jié)功能，能激活巨噬細胞、T細胞和自然殺傷細胞。此外，GPs可以改善腸道代謝并調(diào)節(jié)腸道菌群，特別是增強代謝人參皂甙的細菌Lactobacillus spp.和Bacteroides spp.的生長。
【疾病和腸道菌群】肺癌在全球有極高的發(fā)病率和死亡率，其中約80-85％是非小細胞肺癌（NSCLC）。程序性死亡1（PD-1）及其配體PD-L1的抑制藥物，是缺乏EGFR或ALK突變的轉(zhuǎn)移性NSCLC的有效療法，但其緩解率（<25％）較低，甚至?xí)?dǎo)致過度進展性疾病（HPD），因此需要更有效的方法治療大多數(shù)的晚期NSCLC患者。已有研究證實PD-1/PD-L1通路抑制劑與具有免疫調(diào)節(jié)作用的療法或藥物組合，可增強抗腫瘤反應(yīng)。近期，腸道菌群引發(fā)了人們對癌癥免疫療法的關(guān)注：如Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium等，無論在臨床前腫瘤模型還是癌癥患者上，均表現(xiàn)出了對提高免疫治療的良好反應(yīng)。 因此，調(diào)節(jié)腸道微生物群的策略，被認為能夠用于治療癌癥患者，并作為新的免疫治療響應(yīng)預(yù)測生物標志物。
在癌癥免疫治療中，人參多糖（GPs）的治療潛力尚需探究，澳門科技大學(xué)等研究團隊通過小鼠模型和臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)：GPs與αPD-1單克隆抗體（mAb）具有協(xié)同抗腫瘤作用，或能通過調(diào)控腸道菌群組成及代謝物的方式調(diào)節(jié)免疫，進而增強對免疫治療的應(yīng)答。相關(guān)研究成果發(fā)表于頂級期刊《Gut》。
研究路線
主要研究結(jié)果
一、聯(lián)合治療對動物模型的抗腫瘤作用
研究者首先評價了C57 BL / 6J小鼠負荷Lewis肺癌細胞（LLC）模型的腫瘤生長和發(fā)展情況。腫瘤接種后0天給小鼠進行GPs灌胃，第9天進行αPD-1mAb注射（圖A），以腫瘤體積和重量評估其抗腫瘤效果。GPs聯(lián)合αPD-1mAb治療顯著降低了腫瘤進展，腫瘤生長受抑制，小鼠存活期延長（圖B-D）。
同時，聯(lián)合治療在HuPD-1小鼠負荷LLC細胞（圖E-F）和B16-F10荷瘤的小鼠模型中也有明顯抗腫瘤作用效果。
二、聯(lián)合治療對免疫系統(tǒng)的作用
為了確定聯(lián)合治療對免疫系統(tǒng)的影響，作者分析了外周血、脾臟和腫瘤組織的免疫相關(guān)變化：
1. CD8+T 細胞：聯(lián)合治療組中，外周（血液和脾臟）和腫瘤組織中CD8+ / CD4+比率均增加（圖A)；CD8+ T細胞中功能性細胞因子IFN-γ，TNF-α和GZMB的產(chǎn)生也均增加（圖B–D）。
2. 調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）：Tregs是免疫抑制腫瘤微環(huán)境的主要參與者，通常與預(yù)后不良和生存率相關(guān)。聯(lián)合治療引發(fā)外周和腫瘤組織FoxP3+調(diào)節(jié)性T (Treg)細胞的減少(圖E），這可能有助于預(yù)防HPD。
免疫組化分析在腫瘤組織中得到與上述一致的結(jié)果（圖F–K）。以上結(jié)果表明，聯(lián)合治療可通過激活CD8+ T細胞并抑制Tregs的功能而發(fā)揮作用。
三、聯(lián)合治療對腸道微生態(tài)的影響
1. 腸道微生物結(jié)構(gòu)變化
采用16S PicBio SMRT測序?qū)S便樣本研究，與αPD-1單抗組相比，聯(lián)合治療后微生物組成發(fā)生變化，Muribaculum豐度明顯增加(圖A-B)。與模型組相比，GPs組的Muribaculaceae豐度增加，這表明GPs可能會影響Muribaculaceae豐度。
2. 抗生素處理：抗生素處理使得各組抗腫瘤效果沒有差異(圖C-D)，說明上述效應(yīng)依賴于腸道菌群。
3. 對腸道多種細胞群的影響：
a. 結(jié)腸中炎性細胞：減少結(jié)腸中炎性細胞的浸潤(圖E-F)。
b. 上皮內(nèi)淋巴細胞（IELs）：IELs在維持障礙功能和降低對感染和免疫病理學(xué)的易感性方面發(fā)揮著重要作用。研究者對小腸中IELs進行了轉(zhuǎn)錄組研究：與單獨的αPD-1mAb組比，聯(lián)合治療組中的上皮保護基因、代謝相關(guān)基因和S100A6明顯上調(diào)；相反，免疫球蛋白可變區(qū)重鏈基因、免疫球蛋白可變區(qū)輕鏈基因和免疫球蛋白kappa變量基因等下調(diào)（圖G）；GO分析顯示，差異表達的基因主要與溶酶體、分泌顆粒和能量代謝有關(guān)，這些基因可以保護腸屏障的完整性（圖H）。與GPs組比，聯(lián)合治療組的免疫應(yīng)答相關(guān)基因上調(diào)（圖I，J）。
c. RORγt+ Treg細胞：RORγt+ Treg細胞可被菌群刺激所誘導(dǎo)，RORγt+Treg/Th17細胞間比例可維持腸道動態(tài)平衡。聯(lián)合治療組使RORγt+ Treg細胞的比例增加，而Th17細胞比例降低（圖K-L），說明其對腸道有保護作用。
四、聯(lián)合治療對菌群相關(guān)代謝物的影響
1. 短鏈脂肪酸
微生物可能通過短鏈脂肪酸（SCFAs）誘導(dǎo)RORγt+ Tregs產(chǎn)生進而達到抗腫瘤效果。SCFAs作為能量來源能阻止營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的腸上皮細胞和淋巴細胞自噬，還可進入血液，進而通過GPCR受體途徑或抑制HDAC表觀活性而影響其他的組織和細胞。SCFAs在菌群調(diào)控免疫治療過程中具有重要作用。
該研究利用質(zhì)譜法檢測了血漿中SCFAs的水平。結(jié)果顯示：αPD-1mAb處理后，除乙酸外，其他SCFAs豐度均增加。與單獨使用αPD-1mAb的組比，聯(lián)合治療組中的戊酸豐度增加更顯著（圖A–G）。
2. 色氨酸代謝
作者進一步檢測了氨基酸和脂肪酸代謝物的變化。與單獨使用αPD-1mAb組比，聯(lián)合治療組中，色氨酸代謝在這些代謝產(chǎn)物中貢獻最大，L-犬尿氨酸與犬尿氨酸/色氨酸（Kyn / Trp）的比率（表示為IDO活性）顯著降低，但L-色氨酸沒有顯著變化。為了進一步研究IDO在腫瘤組織中的活性，通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組IDO的表達水平下調(diào)（圖K）。
為了確定GPs對腸道微生物中色氨酸代謝的影響，通過體外發(fā)酵對GPs進行人糞便樣品的發(fā)酵。研究發(fā)現(xiàn)GPs在有氧和厭氧下均顯著增加L-色氨酸的產(chǎn)生，并降低犬尿氨酸的產(chǎn)生，以及Kyn / Trp的比例，這表明GPs可能通過腸道微生物影響色氨酸代謝。
五、臨床分析：免疫治療響應(yīng) VS 非響應(yīng)患者的腸道菌群差異
16例中國NSCLC患者接受抗PD-1阻斷治療，10例為有響應(yīng)者(Rs)，6例為無響應(yīng)者(NRs)。為了研究腸道微生物組成是否與抗PD-1免疫療法有關(guān)，對糞便樣本進行16S PacBio SMRT測序。
響應(yīng)者(Rs)的腸道微生物的豐富度和均勻度高于無響應(yīng)者(NRs)（圖A）。在物種水平上，Rs組擬桿菌的相對豐度居首位，其次是Parabacteroides distasonis 、bacterium LF-3和Sutterella wadsworthensis HGA0223。并且這些細菌豐度在響應(yīng)好、生存率更高的患者也是增加的（圖B-E）。
六、糞便移植
將6位NRs的糞便轉(zhuǎn)移到無菌小鼠中，菌群定植后進行LLC腫瘤細胞接種。然后，用上述相同的GPs方案進行治療（圖A）：
1. 藥效
如預(yù)期一致，小鼠對αPD-1mAb治療具有抗性。但用GPs加αPD-1mAb聯(lián)合治療，顯著減緩了腫瘤的生長（圖B）。
2. 對免疫系統(tǒng)的影響
流式細胞和免疫組化分析提示血液和腫瘤中CD8+ / CD4+ T細胞的比例、CD8+T細胞中的IFN-γ、TNF-α和GZMB增加（C-F，H–M）。此外聯(lián)合組Treg細胞更少，這與治療功效的提高相關(guān)（圖G）。
3. 對色氨酸代謝的影響
聯(lián)合治療后Kyn / Trp比值降低（圖J），腫瘤組織中的IDO表達較低（圖K-L）。
4. 對腸道菌群的影響
與αPD-1 mAb組和模型組比，聯(lián)合治療擬桿菌(Bacteroides)豐度顯著增加，尤其是B. vulgatus和P. distasonis(圖M-O）。這些結(jié)果表明，聯(lián)合處理可重塑腸道微生物群，從NRs向Rs轉(zhuǎn)變，從而使αPD-1單抗治療的反應(yīng)敏感。
主要結(jié)論
以肺癌荷瘤小鼠為模型，人參多糖能增強抗PD-1單抗的抗腫瘤效果，伴隨活化CD8+T細胞增加，調(diào)節(jié)性T細胞減少。抗腫瘤作用可能依賴于其對腸道菌群的影響，通過微生物組和菌群代謝組研究發(fā)現(xiàn)：腸道菌群組成和代謝物發(fā)生明顯改變，包括戊酸增高、犬尿氨酸/色氨酸代謝變化等。聯(lián)合治療上調(diào)了上皮細胞相關(guān)保護基因的表達，同時短鏈脂肪酸和犬尿氨酸進一步進入血液循環(huán)，增強免疫功能，進而抑制腫瘤生長、延長生存期。
臨床研究中進一步發(fā)現(xiàn)，抗PD-1治療響應(yīng)者的腸道菌群多樣性更高，狄氏副擬桿菌和普通擬桿菌的豐度更高。接受非響應(yīng)患者菌群的小鼠，其對抗PD-1治療的敏感性，可通過人參多糖治療予以恢復(fù)。
腫瘤免疫治療響應(yīng)與腸道菌群的關(guān)系被越來越多地證明和關(guān)注。免疫調(diào)控是中醫(yī)藥的優(yōu)勢功能, 該研究揭示了中藥通過調(diào)控腸道菌群增強腫瘤免疫治療的巨大應(yīng)用潛力。
