?CRISPR/Cas9作為一項(xiàng)有力的基因編輯工具，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。隨著研究的深入，越來越多與其相關(guān)的研究工具已經(jīng)被開發(fā)出來，包括基因敲除，基因過表達(dá)，將外源片段定點(diǎn)整合進(jìn)入基因組，單堿基編輯，文庫高通量篩選等。
目前已有不少在體的研究也都在利用CRISPR/Cas9技術(shù)。在結(jié)合AAV病毒載體后，擁有廣泛的應(yīng)用前景和臨床意義1。但很多在體研究還局限在敲除基因上面，原因是CRISPR/Cas9介導(dǎo)的KO依賴的是DNA雙鏈斷裂修復(fù)后引入或者缺失片段導(dǎo)致的移碼，相對(duì)較容易實(shí)現(xiàn)。如果想要精確的編輯某個(gè)基因，例如進(jìn)行單堿基突變或者插入某個(gè)片段或者精確刪除某個(gè)DN**段則難度較高。
因?yàn)槌Ｒ?guī)的看法是，這類精確編輯依賴的是HDR（同源重組介導(dǎo)的修復(fù)），但HDR的編輯效率非常低，體外研究通常占比低于5%。且HDR修復(fù)通路具有強(qiáng)烈的細(xì)胞周期依賴，發(fā)生在S/G2期，所以利用HDR來進(jìn)行在體的基因編輯其效果受到很大限制，應(yīng)用較少。
特在此為大家推薦其它一些高效且精確的基因編輯策略或者技術(shù)，這些方案都可以通過AAV或者慢病毒載體來實(shí)現(xiàn)。
# 單堿基編輯技術(shù)
在單堿基編輯技術(shù)出現(xiàn)之前，為了在基因上引入單堿基突變，只能依賴HDR修復(fù)途徑。而這個(gè)過程需要產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，還要引入donor序列，且效率非常低。
將胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1融合到dCas9的N端使得該融合蛋白可以將胞嘧啶（C）的氨基水解掉，從而變成尿嘧啶（U），這個(gè)水解過程發(fā)生在與sgRNA非互補(bǔ)的鏈上。由于尿嘧啶不是DNA的常規(guī)組分，細(xì)胞內(nèi)的堿基切除修復(fù)通路（BER），將會(huì)識(shí)別DNA中的尿嘧啶，并將其切除，而這將抑制單堿基編輯的效率。一段尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）序列被融合到dCas9蛋白的C端，可以有效地阻止編輯點(diǎn)附近尿嘧啶被切除。
此時(shí)該位點(diǎn)的序列為U:G配對(duì)，隨著著細(xì)胞分裂將產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞，在該位點(diǎn)的序列分別為U:A和C:G。其中U:A的子細(xì)胞序列進(jìn)一步分裂或者通過BER修復(fù)就變成T:A配對(duì)，最終完成C:G到T:A的轉(zhuǎn)變2。
由于最后一步的編輯依賴細(xì)胞分裂，為了降低這種依賴性，并進(jìn)一步提高編輯效率，如何將非分裂細(xì)胞中的U:G突變成U:A就成了下一個(gè)研究的關(guān)鍵點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)存在另外一條錯(cuò)配修復(fù)通路（MMR），可以將錯(cuò)配的堿基進(jìn)行修復(fù)，例如前面不匹配的U:G。
如何讓MMR將U:G配對(duì)修復(fù)為U:A而非C:G呢？MMR會(huì)將含有缺刻的一條鏈識(shí)別為新合成的DNA鏈，從而切除這條鏈上錯(cuò)配的堿基，并以另外一條鏈為模板進(jìn)行修復(fù)。因此通過將dCas9的HNH酶切位點(diǎn)恢復(fù)活性，就可以切割與sgRNA互補(bǔ)的DNA鏈，即U:G配對(duì)中堿基G所在的鏈（圖1）。
相對(duì)于利用HDR引入點(diǎn)突變，單堿基編輯的效率明顯提高，達(dá)到15%-75%。這意味著如果在體實(shí)驗(yàn)需要引入或者修正點(diǎn)突變，完全可以通過單堿基編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)。前面介紹的這個(gè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)CT或者GA的突變，而如果將這個(gè)系統(tǒng)中胞嘧啶脫氨酶替換成腺嘌呤（A）脫氨酶，則可以實(shí)現(xiàn)AG或者TC的突變3。并且更適合AAV載體的saCas9也開發(fā)出了相關(guān)的系統(tǒng)4。
圖 1 單堿基編輯示意圖
#非同源依賴的片段整合（HITI）
如果想在體地在基因中引入某些片段，HDR的低效同樣使人望而卻步。在此也為大家介紹一項(xiàng)更高效的片段整合的技術(shù)HITI。眾所周知，末端連接修復(fù)通路（NHEJ或者M(jìn)MEJ）可以將兩個(gè)斷裂末端連接起來。
因此，在我們預(yù)想插入DN**段的位置通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割生成一個(gè)斷裂末端，此刻斷裂點(diǎn)附近如果有DN**段，這個(gè)DN**段很可能會(huì)被通過末端連接的方式整合進(jìn)入基因組，這也就是HITI的基本原理。這里提到的DN**段也是一段donor序列，和HDR過程中提供的donor相比，HITI的donor序列只需要包含插入序列，而不需要兩側(cè)的同源序列。與HDR對(duì)比，HITI由于依賴的是末端連接的修復(fù)方式，其效率要高出非常多。且由于不依賴于細(xì)胞周期，可以用于終末分化的體細(xì)胞的編輯5。
這里簡(jiǎn)單介紹一下HITI的donor序列的設(shè)計(jì)。對(duì)于HDR，由于有兩側(cè)的同源序列，所以不用擔(dān)心插入片段的方向問題。但對(duì)于HITI，由于依賴的是末端連接的修復(fù)方式，所以如何避免片段被反向連入是需要考慮的問題。作為解決方案，在HITI的donor質(zhì)粒中引入一個(gè)和基因組上靶點(diǎn)相同的序列，但方向和相對(duì)于插入序列的方向和基因組上靶點(diǎn)方向相反。
所以該序列也會(huì)被sgRNA識(shí)別并切割，切割之后如果正向連接進(jìn)入預(yù)期位置，連接位置不會(huì)形成新的sgRNA靶點(diǎn)。但如果是反向連接進(jìn)預(yù)期位置，就會(huì)和載體上序列重新形成sgRNA靶點(diǎn)，從而被二次識(shí)別并切割，從而保證了插入序列的方向性（圖2）。
圖 2 通過控制donor質(zhì)粒上靶點(diǎn)的方向?qū)崿F(xiàn)插入片段的定向插入
可以看到HITI的修復(fù)效率相較于HDR高出非常多（圖3），并且雖然長期認(rèn)為末端連接的修復(fù)方式將引入小片段的插入或者確實(shí)（indel），但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，沒有indel的修復(fù)結(jié)果依然占據(jù)了多數(shù)。這很可能與NHEJ的修復(fù)方式有關(guān)系，已有報(bào)道證明NHEJ連接兩個(gè)沒有修飾的斷裂末端時(shí)，會(huì)傾向于無indel的修復(fù)結(jié)果。典型的，如將CtiP敲除，將促進(jìn)NHEJ，而導(dǎo)致片段敲除中精確連接的比例明顯升高。
因此無論是從修復(fù)效率來看，或者是精確修復(fù)的絕對(duì)比例看，HITI都是更適合體內(nèi)研究片段插入的技術(shù)。
圖 3 HITI修復(fù)效率于HDR對(duì)比
#微同源介導(dǎo)片段刪除
對(duì)于精確的片段插入或者點(diǎn)突變我們都介紹了相對(duì)于HDR更高效的方案，那么對(duì)于片段的精確刪除是否也有更高效的方案呢？在特定情況下是有的。
我們之前有介紹過，CRISPR/Cas9所介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂的修復(fù)結(jié)果并不是隨機(jī)的（注意！Cas9介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂修復(fù)結(jié)果不是隨機(jī)的?。?/a>
具有高度可重復(fù)性。雖然目前還不確定這種修復(fù)結(jié)果的有序性具體是如何實(shí)現(xiàn)的，但是可以明確是，和細(xì)胞本身的DNA雙鏈斷裂修復(fù)系統(tǒng)，細(xì)胞周期，DNA斷裂點(diǎn)附近序列有高度的相關(guān)性。
因此通過大數(shù)據(jù)分析結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)，在一定程度上可以預(yù)測(cè)修復(fù)后的DNA序列。圖4和圖5介紹了兩個(gè)預(yù)測(cè)修復(fù)結(jié)果的網(wǎng)站6 7。圖中用于預(yù)測(cè)的序列具有很強(qiáng)的微同源重復(fù)序列，預(yù)測(cè)結(jié)果都顯示近80%比例的基因組在修復(fù)后將缺失中間8bp重復(fù)序列。
圖 4 網(wǎng)站預(yù)測(cè)Cas9介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂結(jié)果（點(diǎn)擊查看）
圖 5 網(wǎng)站預(yù)測(cè)Cas9介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂結(jié)果（點(diǎn)擊查看）
實(shí)際上這段序列來源于另外一篇研究MMEJ精確介導(dǎo)重復(fù)片段刪除的文章，上面兩個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果和文章內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度吻合8。TCAP基因中8bp的重復(fù)將導(dǎo)致閱讀框移碼從而失活蛋白，最終導(dǎo)致后肢肌肉不良綜合征（LGMD2G）。當(dāng)在重復(fù)序列附近設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)，通過Cas9切割產(chǎn)生雙鏈斷裂后，細(xì)胞將利用MMEJ修復(fù)通路刪除重復(fù)的序列。
從結(jié)果看，在編輯后77%的細(xì)胞至少擁有了一個(gè)野生型基因（圖6）。這暗示我們，對(duì)于擁有某些特定序列的基因組，在雙鏈斷裂后，其修復(fù)結(jié)果會(huì)更傾向于形成單一的修復(fù)結(jié)果，尤其是部分具有高度微同源序列的DNA。
利用這種特性，我們可以實(shí)現(xiàn)特定片段的精確刪除，且具有超高的效率。但是需要注意的一點(diǎn)是，MMEJ和HDR一樣具有細(xì)胞周期的依賴性，主要發(fā)生在S/G2期，因此如果用該方案去編輯已經(jīng)退出分裂周期細(xì)胞或者終末分化的細(xì)胞，將極大地影響效率。
圖 6 MMEJ修復(fù)切除重復(fù)片段
對(duì)于本期介紹到的技術(shù)，如果感興趣，歡迎致電吉?jiǎng)P進(jìn)行咨詢探討。
