請看如何運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究的經(jīng)典套路“相對定量蛋白質(zhì)組（篩選）+絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)（驗(yàn)證）”，在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)頂尖雜志“Theranostics”上玩出不一樣的火花！
■ 文章標(biāo)題
■ 作者及課題組介紹
本文第一作者為上海交通大學(xué)薛婷博士，薛婷博士在蛋白組學(xué)領(lǐng)域有著豐富經(jīng)驗(yàn)，擅長疾病蛋白組學(xué)研究。
本文第一作者課題組為上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物傳熱傳質(zhì)實(shí)驗(yàn)室徐學(xué)敏課題組及系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)威課題組。
■ 研究背景
轉(zhuǎn)移性乳腺癌是威脅全球女性生命健康的頭號(hào)殺手，治愈率低。徐學(xué)敏課題組多年來致力于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌新方法的研究，自主研發(fā)了“冷熱交替治療系統(tǒng)”，該系統(tǒng)在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療上展現(xiàn)出了良好的治療效果。
該系統(tǒng)不僅能殺滅原位腫瘤，而且能有效抑制遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，激發(fā)強(qiáng)而持久的抗腫瘤免疫效應(yīng)，有效提升小鼠長期生存率（>60%）。
為更好地探索該系統(tǒng)在激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)的機(jī)制，徐學(xué)敏課題組聯(lián)合嚴(yán)威課題組，應(yīng)用高通量的蛋白組學(xué)技術(shù)，在大規(guī)模樣品上對血清糖蛋白質(zhì)組展開研究。
■ 研究過程及結(jié)果
研究運(yùn)用經(jīng)典的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法iTRAQ聯(lián)合近來興起的絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法PRM這兩種技術(shù)，在基于Orbitrap的質(zhì)譜平臺(tái)上，獲得了高質(zhì)量、高可信度的數(shù)據(jù)，為解析冷熱交替治療引發(fā)的抗腫瘤免疫機(jī)制奠定了良好基礎(chǔ)。
圖1. 處理與未處理小鼠的血清糖蛋白多組定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析
套路第一步
相對定量蛋白質(zhì)組（篩選）
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研究人員采集了冷熱交替治療后8個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠血清，通過富集血清中糖蛋白，利用iTRAQ標(biāo)記和off-gel分離，比較治療與非治療小鼠在相同時(shí)間點(diǎn)下糖蛋白譜的變化。
研究人員共鑒定到308個(gè)糖蛋白，其中231個(gè)糖蛋白被定量，53個(gè)糖蛋白被定義為差異蛋白。研究人員發(fā)現(xiàn)冷熱交替治療引發(fā)的生物學(xué)響應(yīng)具有時(shí)間特征，而急性應(yīng)激響應(yīng)是其率先引發(fā)的生物學(xué)事件，提示其在抗腫瘤效應(yīng)中的作用。
圖2. 蛋白質(zhì)組隨時(shí)間進(jìn)程的定量變化
套路第二步
絕對定量蛋白質(zhì)組（驗(yàn)證）
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隨后，研究人進(jìn)一步挑選了23個(gè)差異糖蛋白，利用高靈敏度、高選擇性的PRM 靶向蛋白組學(xué)技術(shù)，對其在8個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的表達(dá)展開了靶向驗(yàn)證，該驗(yàn)證共涉及94份（體現(xiàn)了質(zhì)譜高通量的優(yōu)勢）小鼠血清樣品。
研究發(fā)現(xiàn)，冷熱交替治療激發(fā)了機(jī)體快速、強(qiáng)烈的急性應(yīng)激響應(yīng)，伴隨著一系列急性應(yīng)激蛋白短時(shí)間內(nèi)高水平的表達(dá)，扭轉(zhuǎn)了機(jī)體內(nèi)腫瘤介導(dǎo)的慢性炎癥環(huán)境，打破了Th2型的腫瘤免疫抑制生態(tài)圈。急性應(yīng)答微環(huán)境激發(fā)DC細(xì)胞成熟、Th1型記憶型細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1型抗腫瘤免疫效應(yīng)，最終消退原位腫瘤，有效抑制遠(yuǎn)端腫瘤的形成和發(fā)展?；诎邢蝌?yàn)證的蛋白組學(xué)研究能夠進(jìn)一步幫助研究者從系統(tǒng)性的角度了解冷熱交替治療所誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。
圖3. 使用平行反應(yīng)監(jiān)測 (PRM) 技術(shù)對急性應(yīng)激響應(yīng)和白細(xì)胞活性相關(guān)蛋白繪制時(shí)間變化曲線，驗(yàn)證蛋白變化
■ 研究總結(jié)
本研究利用相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法（iTRAQ，當(dāng)然也可以有TMT、label-free等），從整體上描繪了治療后血清糖蛋白組的變化；并聯(lián)合運(yùn)用絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)PRM ，對目標(biāo)蛋白進(jìn)行了靶向驗(yàn)證和研究。
PRM的驗(yàn)證結(jié)果與 shotgun 有較好的可關(guān)聯(lián)性，其更強(qiáng)的靈敏度及選擇性，能夠提供更好的定量信息。相比傳統(tǒng)的依賴抗體驗(yàn)證的手法 (WB，ELISA)，PRM在通量、效率、成本以及適用范圍上，有明顯的優(yōu)勢。
相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)和絕對蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的金標(biāo)準(zhǔn)，在復(fù)雜臨床樣本（血清、組織、穿刺、石蠟包埋）及翻譯后修飾相關(guān)研究中具有無可匹敵的優(yōu)勢，是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的必備武器。
本文轉(zhuǎn)自O(shè)rbitrap組學(xué)俱樂部，稍作修改，如有問題，請隨時(shí)與我們聯(lián)系。
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