大腦由數(shù)百萬個神經(jīng)元細胞組成，了解這些神經(jīng)元如何連接在一起可以更好地解析大腦的工作方式。為了更容易區(qū)分大腦中的單個神經(jīng)元，通常需要一種特殊標(biāo)記方法，隨機標(biāo)記一小部分神經(jīng)元以突出它們的樹突和軸突精細結(jié)構(gòu)以及走向，稱為稀疏標(biāo)記。今天，我們盤點下幾種常用的基于熒光成像的神經(jīng)稀疏標(biāo)記方法。
一、多色標(biāo)記系統(tǒng)
隨機多色標(biāo)記方法“Brainbow”是一種可以用不同熒光蛋白對多個神經(jīng)元進行差異標(biāo)記，但該系統(tǒng)熒光亮度不足，Sakaguchi等人基于此系統(tǒng)，引入四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)，稱為“Tetbow”，成功增強了熒光強度，實現(xiàn)對神經(jīng)元的標(biāo)記：
是不是亮度還不夠？作者進一步使用SeeDB2 作為組織清除劑，減少甘油 (SeeDB2G) 或油 (SeeDB2S) 浸沒物鏡的球面像差，提高3D高分辨率成像。將Tetbow系統(tǒng)質(zhì)粒通過電穿孔引入大腦皮層的第 2/3 層神經(jīng)元，樹突棘的詳細結(jié)構(gòu)，軸突，神經(jīng)元形態(tài)的精細細節(jié)都清晰地可視化
通過將不同熒光的載體混合共同注射腦部，實現(xiàn)不同細胞染上不同的熒光，以區(qū)分不同的神經(jīng)元，再以四環(huán)素系統(tǒng)調(diào)整不同神經(jīng)元的亮度，以實現(xiàn)明暗的標(biāo)記對比，可以預(yù)見的是，混合的熒光類型越多，可能稀疏標(biāo)記程度越高。
二、基于化學(xué)標(biāo)簽的成像
組織的透明度與對熒光蛋白的損傷之間存在權(quán)衡，水性組織清除劑可用于熒光蛋白的大規(guī)模三維成像。然而，要徹底清除富含脂質(zhì)的有髓軸突，必須使用清潔劑、溶劑和加熱等苛刻的清除處理方法，大多數(shù)基于溶劑的清除方法會導(dǎo)致熒光蛋白的淬滅。為了克服這個問題，作者開發(fā)出來基于SNAP、Halo、CLIP 和 TMP等化學(xué)標(biāo)簽的標(biāo)記系統(tǒng)Tetbow，這些標(biāo)簽分子量相對較小，易于滲透到厚組織中。一旦它們與其底物形成共價鍵，并與合成標(biāo)簽一起發(fā)出熒光，即使在苛刻的透明條件下，熒光也能保持穩(wěn)定。
化學(xué)標(biāo)簽在苛刻的清除條件下是穩(wěn)定的，意味著可以有更廣泛的清除方法選擇，特別是對于富含脂質(zhì)的厚組織。其次，與熒光蛋白相比，化學(xué)標(biāo)簽可以提供更多的熒光光譜和光化學(xué)特性選擇。例如，合成熒光團覆蓋了從紫外到近紅外范圍的光譜，在成像時擴大了可能的光譜范圍。
三、基于MORF的稀疏成像
DNA 微衛(wèi)星，如基因組中的單核苷酸重復(fù)序列，在 DNA 復(fù)制或修復(fù)過程中容易受到隨機移碼突變的影響。通過構(gòu)建CRE依賴的熒光報告系統(tǒng)，在翻譯起始密碼子ATG與熒光蛋白之間，插入重復(fù)的堿基C，在 Cre +在細胞后代中，floxed內(nèi)的轉(zhuǎn)錄終止序列被移除，但由于單核苷酸重復(fù)作為框架外的“翻譯開關(guān)”，大多數(shù)細胞仍然無法翻譯 MORF 報告蛋白，只有單核苷酸重復(fù)是3的倍數(shù)，膜結(jié)合報告蛋白才會被翻譯以標(biāo)記細胞形態(tài)
基于上述原理，作者構(gòu)建了單核苷酸重復(fù)移碼 (MORF) 作為隨機平移開關(guān)賦予 Cre 依賴稀疏細胞標(biāo)記的四個小鼠品系，以及引入四環(huán)素表達的改造型TIGRE-MORF，兩者都能實現(xiàn)神經(jīng)元的稀疏標(biāo)記和隨機表達：
該系統(tǒng)利用重復(fù)堿基復(fù)制時，會隨機缺失作為熒光表達的開關(guān)，將熒光定位于細胞膜以標(biāo)記更清楚的神經(jīng)元形態(tài)，只需將報告系統(tǒng)做成小鼠，即可配合不同神經(jīng)元啟動子表達的CRE病毒或者CRE鼠雜交，即可實現(xiàn)不同神經(jīng)元的形態(tài)標(biāo)記。對于需要研究多種神經(jīng)類型標(biāo)記的需求，無需注射多種病毒，就能開展后續(xù)研究。
四、多AAV標(biāo)記系統(tǒng)
羅敏敏/龔輝合作，開發(fā)了基于四環(huán)素、CRE/loxp、FLP/frt三者合一的AAV遞送系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理是:FLP重組酶受CRE酶的誘導(dǎo)特異性表達，稱為控制子；FLP又特異性調(diào)控GFP和rTA的表達,其中，GFP是報告系統(tǒng)，rTA是四環(huán)素系統(tǒng)的調(diào)控蛋白，其表達之后可以激活兩大系統(tǒng)TRE啟動子的表達。該系統(tǒng)的亮點是，不需要額外加四環(huán)素開啟系統(tǒng)表達，而是利用TRE本身的泄露表達，自行刺激第二個病毒GFP的表達，形成正向表達反饋，因此成為放大子。
作者利用雙病毒共同注射多巴胺啟動子控制的CRE鼠VTA區(qū)，三周后取腦部切片，獲取了十五個多巴胺神經(jīng)元的投射圖：
該系統(tǒng)也可以對單個神經(jīng)元進行標(biāo)記，利用retro血清型（不跨突觸的逆行標(biāo)記）對軸突遞送CRE重組酶，將 AAV-retro-Cre 病毒注射到背側(cè)紋狀體中，雙 AAV 病毒混合到皮層區(qū)域，只有同時感染上三種病毒的才得以標(biāo)記，在C57BL/6 中稀疏標(biāo)記了九個皮質(zhì)紋狀體神經(jīng)元的投射老鼠，并繪制了九個神經(jīng)元的網(wǎng)絡(luò)圖。
與前幾種同樣使用四環(huán)素系統(tǒng)的方法不同，該系統(tǒng)無需給小鼠補充誘導(dǎo)劑，而是利用系統(tǒng)本身的泄露機制實現(xiàn)對部分神經(jīng)元的標(biāo)記，與多色標(biāo)記相比，有更高的分辨率。
稀疏標(biāo)記的核心設(shè)計原理是實現(xiàn)對部分神經(jīng)細胞的隨機標(biāo)記，而鄰近細胞不標(biāo)記，因此，多采取四環(huán)素系統(tǒng)以控制熒光表達強度，再配合本文所列的其他控制系統(tǒng)（多病毒競爭感染、重復(fù)堿基開關(guān)、重組酶系統(tǒng)）形成部分細胞熒光重新的高分辨率，當(dāng)然，后期的組織樣本處理也至關(guān)重要。本文重點簡述稀疏標(biāo)記的病毒及動物模型設(shè)計原理，各有優(yōu)劣，需要考慮自身實驗需求及條件選取標(biāo)記系統(tǒng)。
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