Super enhancer，SE，即超級(jí)增強(qiáng)子，是一類具有超強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活特性的DNA順式調(diào)控元件，它們共同控制涉及細(xì)胞身份的關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)，并與眾多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是當(dāng)前科研領(lǐng)域的又一藍(lán)海，之前吉?jiǎng)P的科研大咖已經(jīng)分享過SE涉及的研究領(lǐng)域以及熱點(diǎn)方向<<研究不夠“高大上”？想沖刺高分文章？一起來看看 Super enhancer吧!>>，今天我們談?wù)劻硪粋€(gè)話題，如何進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)？
在Richard A. Young于2013年提出SE概念之前，大部分學(xué)者研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件多局限于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，這些調(diào)控序列一般較短且挨著啟動(dòng)子，因此可以直接采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，構(gòu)建 “增強(qiáng)子+啟動(dòng)子”的全序列研究對(duì)應(yīng)增強(qiáng)子的功能。但SE是一類在基因組上跨度較大（長約幾K至上百K），且遠(yuǎn)離其調(diào)控的基因，很多老師依然想采取傳統(tǒng)的“增強(qiáng)子+啟動(dòng)子”的方式驗(yàn)證，顯然是不合理的，
原因在二，第一：SE跨度較大，超出構(gòu)建質(zhì)粒的范疇；第二：人為將SE與啟動(dòng)子拉近構(gòu)建（在基因組不挨著，但是構(gòu)建的時(shí)候人為拼接在一起），并不能說明隔空的SE會(huì)對(duì)遠(yuǎn)端的啟動(dòng)子有調(diào)控作用。
因此，小編就盤點(diǎn)主要的獲得ChIP數(shù)據(jù)之后的SE功能如何驗(yàn)證！！
（一）金標(biāo)準(zhǔn)：SE缺失
//適用場景：SE跨度大；不明確SE含有的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)
要確認(rèn)SE是否調(diào)控遠(yuǎn)端基因，最理想的情況為將SE缺失，直接驗(yàn)證基因的表達(dá)水平。Sox2是維持胚胎干細(xì)胞 (ESC) 的多能性的主轉(zhuǎn)錄因子之一，Bing1等人通過H3K27ac ChIP-seq 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)位于 Sox2 基因座下游約 100kb，有一個(gè)跨越長度約為13kb的區(qū)域，有潛在的SE功能：
作者認(rèn)為，報(bào)告基因檢測證實(shí)該序列可以作為外源性增強(qiáng)子發(fā)揮作用，但并未證明遠(yuǎn)端靶基因是否可以在體內(nèi)被增強(qiáng)子激活。敲除增強(qiáng)子序列是金標(biāo)準(zhǔn)方法，因此，針對(duì)該SE兩側(cè)各設(shè)計(jì)了一個(gè)CRISPR的cas9靶點(diǎn)，將其切割，并通過PCR以及QPCR驗(yàn)證了一部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)了SE的缺失：
由于缺失了SE，Sox2表達(dá)水平下降明顯，且正如預(yù)期的那樣，由于 Sox2 和其他幾種多能性因子的表達(dá)降低，Sox2-SE遠(yuǎn)端缺失影響了mESC 培養(yǎng)物的增殖和形態(tài)
（二）SE關(guān)鍵位點(diǎn)抑制/激活
// 適用場景：已明確核心位點(diǎn)（已知感興趣的位點(diǎn)或者SNP）
若SE跨度短，有明確的研究位點(diǎn)，或者由于突變等因素引發(fā)的SE功能異常，則可以通過重塑局部表觀遺傳達(dá)到研究目的。Xu2等人將 dCas9 與賴氨酸特異性去甲基化酶 LSD1（或 KDM1A）融合，后者催化去除增強(qiáng)子相關(guān)的 H3-Lys4 單甲基化和二甲基化（H3K4me1/2），及 MS2-sgRNA 以招募 MCP-KRAB 抑制域，這套系統(tǒng)稱為enCRISPRi（是dCas9-KRAB的改進(jìn)型）。將 enCRISPRi 靶向高表達(dá)β-珠蛋白基因的 K562 紅白血病細(xì)胞中的 HS2 增強(qiáng)子，與對(duì)照sgGal4相比，四種獨(dú)立的 sgRNA（sgHS2-1 到 sgHS2-4）實(shí)現(xiàn)了對(duì) β-珠蛋白基因（HBE1、HBG1/2和HBB）的3.4至 13.7 倍抑制
作者進(jìn)一步在動(dòng)物水平以enCRISPRi建模，在 T 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病 (T-ALL) 細(xì)胞系和患者中TAL1原癌基因上游 8 kb 增強(qiáng)子發(fā)生突變，雜合體細(xì)胞突變通過在TAL1增強(qiáng)子序列處插入可變數(shù)量的核苷酸獲得，于是客戶設(shè)計(jì)了突變型特異性靶點(diǎn)（sgMut1 和 sgMut2），對(duì)照sgGal4，以及插入序列附近野生型靶點(diǎn)（sgWT1和sgWT2）。結(jié)果表明enCRISPRi有效介導(dǎo)了TAL1 蛋白的表達(dá)，損害了體外 T-ALL 的生長（對(duì)應(yīng)f，g，h）：
同時(shí)，作者還構(gòu)建了激活增強(qiáng)子的系統(tǒng)enCRISPRa，同樣取得了在動(dòng)物模型通過激活增強(qiáng)子實(shí)現(xiàn)基因上調(diào)以及疾病模型的體現(xiàn)（對(duì)應(yīng)c，d，i）。
（三）熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)
//適用場景：尋找SE的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)/位點(diǎn)
作為傳統(tǒng)研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的“雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)”，在SE的研究中，雖然無法說明遠(yuǎn)端調(diào)控的影響，但依然有其用武之地。Michelle等人在研究EBV病毒如何調(diào)節(jié)B細(xì)胞生長時(shí)，發(fā)現(xiàn)EBV 編碼的 EBNA2 轉(zhuǎn)錄因子通過距離RUNX3約-97 kb 超級(jí)增強(qiáng)子內(nèi)的特定元件激活RUNX3，該增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)預(yù)測出六個(gè)EBNA2的結(jié)合位點(diǎn)，為了進(jìn)一步尋找出主調(diào)控區(qū)域，作者構(gòu)建了每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的截?cái)囿w（E表示）與RUNX3啟動(dòng)子-737 到 +44一同構(gòu)建至pGL3 basic，通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)：
當(dāng)含有所有增強(qiáng)子區(qū)域時(shí)，激活高達(dá) 8.4 倍，EBNA2 能夠通過E2 激活高達(dá) 3.8 倍的轉(zhuǎn)錄， E4 和 E6 被 EBNA2 激活高達(dá) 2 倍，因此說明了EBNA2主要通過E2、E4、E6三個(gè)位點(diǎn)調(diào)節(jié)表達(dá)，且E2 是 EBNA2 激活的關(guān)鍵位點(diǎn)。
隨著測序技術(shù)的發(fā)展，相信越來越多的基因組未知功能會(huì)被發(fā)現(xiàn)。SE作為一個(gè)科研方向，正發(fā)展壯大，為基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)又添加了一員大將，且有望成為新的藥物靶標(biāo)。吉?jiǎng)P基因緊跟科研熱點(diǎn)，提供眾多工具類的產(chǎn)品，對(duì)超級(jí)增強(qiáng)子感興趣的老師們，快來咨詢吧！！！
病毒實(shí)驗(yàn)幫
公眾號(hào)底部菜單欄【新功能】上線！
免費(fèi)在線學(xué)習(xí)《國自然熱點(diǎn)研究》、《數(shù)據(jù)庫及軟件操作教程》
一鍵下載《病毒使用手冊(cè)》、《高分文獻(xiàn)》
還有不定時(shí)的送新書、抽獎(jiǎng)活動(dòng)，趕緊來掃碼關(guān)注一波吧