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無(wú)血清培養(yǎng)

細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)需要在培養(yǎng)基中加入血清，以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。而血清，尤其是牛血清，成分復(fù)雜、批間差大和存在病原體污染的可能性，不確定的動(dòng)物源性對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)帶來(lái)顯著的外源物質(zhì)污染風(fēng)險(xiǎn)，因此科研人員對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的需求日益增加，目前無(wú)血清培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)、單抗、活性蛋白等生物制品和細(xì)胞治療等的領(lǐng)域中。無(wú)血清培養(yǎng)基中不含血清，為能夠?qū)崿F(xiàn)與含血清培養(yǎng)基相似的維持和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，其中必須添加白蛋白(Albumin)、胰島素(Insulin) 和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)等營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)替代血清。

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生長(zhǎng)因子在無(wú)血清培養(yǎng)中的作用

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促細(xì)胞貼壁

許多細(xì)胞必須添加促貼壁物質(zhì)才能貼壁生長(zhǎng)，促貼壁物質(zhì)一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白和膠原蛋白等。

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增加細(xì)胞存活率

無(wú)血清培養(yǎng)基中不含有血清成分，細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)成分更為單一，因此細(xì)胞的存活率可能會(huì)受到影響。添加適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子可以改善無(wú)血清培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)條件，進(jìn)而提高細(xì)胞的存活率。無(wú)血清培養(yǎng)必需補(bǔ)充的細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和血清白蛋白等。

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促進(jìn)細(xì)胞增殖和功能維持

生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。在無(wú)血清培養(yǎng)基中，添加一些能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等，能夠有效地促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

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促進(jìn)細(xì)胞分化

生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)細(xì)胞分化，從而促進(jìn)細(xì)胞的功能發(fā)揮。在無(wú)血清培養(yǎng)基中，添加一些能夠促進(jìn)細(xì)胞分化的生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NGF）等，能夠有效地促進(jìn)細(xì)胞的分化。

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提高細(xì)胞表型的穩(wěn)定性

無(wú)血清培養(yǎng)基中不含有血清成分，對(duì)于某些細(xì)胞來(lái)說(shuō)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的表型不穩(wěn)定。添加適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子可以提高細(xì)胞表型的穩(wěn)定性，從而提高細(xì)胞的應(yīng)用效果。

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無(wú)血清培養(yǎng)基中常添加的生長(zhǎng)因子

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堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF)

bFGF是一種肝素結(jié)合促有絲分裂蛋白，可在無(wú)血清或減血清條件下促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖。bFGF是干細(xì)胞培養(yǎng)中的一種關(guān)鍵生長(zhǎng)因子，它不僅是重要的促有絲分裂因子，還是形態(tài)發(fā)生和分化的誘導(dǎo)因子。在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中，bFGF有助于干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中保持未分化狀態(tài)。

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胰島素（Insulin）

胰島素可維持無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的攝取、利用和貯存，同時(shí)抑制糖原、蛋白質(zhì)和脂肪的分解。胰島素也具有對(duì)抗細(xì)胞凋亡的作用。胰島素通常以每升1-10mg的濃度添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中。

表1. 胰島素對(duì)細(xì)胞作用的分類及特點(diǎn)

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胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)

在無(wú)血清培養(yǎng)基的配制中，常用IGF-I 來(lái)替代胰島素，IGF-I 在很低的濃度即可實(shí)現(xiàn)促細(xì)胞生長(zhǎng)作用，而胰島素需要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生理濃度。IGF-1通過(guò)與IGF-1受體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成代謝，影響糖原代謝、DNA合成和葡萄糖攝取，具有抗凋亡作用。在無(wú)血清培養(yǎng)基中，IGF-1有助于細(xì)胞維持較高的活率和持續(xù)增殖的能力。

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長(zhǎng)效IGF-I（LR3 IGF-I）

Long R3 IGF-I (LR3 IGF-I) 也可稱為長(zhǎng)效IGF-I，與胰島素相比，LR3 IGF-I添加到無(wú)血清培養(yǎng)基中后不容易被降解，作用更持久，因此也叫長(zhǎng)效IGF-1。 

LR3 IGF-I 是以IGF-I 為基礎(chǔ)改造而來(lái)。改造后，LR3 IGF-I 仍具有高親合力結(jié)合IGF-IR 的能力，因此保持著與IGF-I 相似的促細(xì)胞增殖活性。同時(shí)，改造后，LR3 IGF-I與IGF 結(jié)合蛋白( IGFBPs)的親合力明顯下降。所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞均會(huì)分泌IGFBPs，而IGFBP可結(jié)合并抑制IGF-I 的活性，而改造后的LR3 IGF-I 與IGFBPs 的親合力比其原型分子IGF-I 下降1000 多倍，因此其活性可極大程度地避免被IGFBPs 所抑制，從而使LR3 IGF-I 的活性較IGF-I 大為提高。

LR3 IGF-1相比胰島素，促細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，培養(yǎng)的細(xì)胞密度更高，細(xì)胞活力更好，且LR3 IGF-1比胰島素在培養(yǎng)液中半衰期更長(zhǎng)，生物活性更長(zhǎng)效。

  表2. 人 LR3 IGF-1、IGF-1和胰島素的區(qū)別

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表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)

一種重要的促有絲分裂生長(zhǎng)因子，通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合，促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖。在無(wú)血清細(xì)胞或減血清條件下培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)多種細(xì)胞的分化。

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肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (HGF)

HGF是成熟實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞的一種強(qiáng)效、間質(zhì)衍生的有絲分裂原，廣泛組織和細(xì)胞類型的生長(zhǎng)因子。HGF通過(guò)MET的跨膜酪氨酸激酶受體發(fā)出信號(hào)。HGF的活性包括誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、形態(tài)發(fā)生、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增強(qiáng)神經(jīng)元存活。HGF是肝臟再生過(guò)程中至關(guān)重要的有絲分裂原。HGF能夠刺激原代無(wú)血清培養(yǎng)的肝細(xì)胞DNA的合成，對(duì)多種組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的生理調(diào)節(jié)功能。

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轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Transferrin)

無(wú)血清培養(yǎng)基為達(dá)到與含血清培養(yǎng)基相同或相似的細(xì)胞培養(yǎng)性能，其中也必須添加轉(zhuǎn)鐵蛋白，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞鐵離子平衡的調(diào)節(jié)，以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的維持。

分類：轉(zhuǎn)鐵蛋白以三種形態(tài)存在：脫鐵（Apo）（不結(jié)合鐵離子）、飽和鐵(Holo）（結(jié)合兩分子鐵離子）和部分飽和。 

如何選擇：無(wú)血清培養(yǎng)基中多數(shù)都添加Holo-transferrin，因?yàn)镠olo-transferrin 除發(fā)揮轉(zhuǎn)鐵作用外，自身即可作為細(xì)胞的鐵源，無(wú)需在培養(yǎng)基中另加外源性鐵。但在某些本身含鐵量高的培養(yǎng)基(如DMEM/F12)中，則可使用Apo-transferrin 這種不含鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白。

使用濃度：細(xì)胞種類不同，對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白的需求量也不同，下表僅供參考。具體的濃度還是要根據(jù)細(xì)胞的種類、狀態(tài)和想要實(shí)現(xiàn)的功能來(lái)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。

表3.轉(zhuǎn)鐵蛋白在無(wú)血清培養(yǎng)基中的使用濃度

轉(zhuǎn)鐵蛋白在無(wú)血清培養(yǎng)基中的作用：

避免細(xì)胞外環(huán)境中自由基的產(chǎn)生，防止細(xì)胞受到傷害

轉(zhuǎn)鐵蛋白可以與鐵離子高親合力結(jié)合，當(dāng)被添加入無(wú)血清培養(yǎng)基后，在細(xì)胞外的培養(yǎng)環(huán)境中基本不會(huì)存在游離的鐵離子，也就不會(huì)發(fā)生自由基反應(yīng)，故可避免自由基對(duì)細(xì)胞的損傷。

維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖

細(xì)胞內(nèi)有很多重要的蛋白，如血紅素、核糖核苷酸還原酶、DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA引物酶等，需要結(jié)合鐵離子后才能發(fā)揮其活性，這些蛋白基本上都與DNA 的復(fù)制、修復(fù)以及DNA 的穩(wěn)定性有關(guān)，也就是說(shuō)它們影響著細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。轉(zhuǎn)鐵蛋白通過(guò)與其在細(xì)胞表面的受體結(jié)合，將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)并釋放到細(xì)胞內(nèi)后，這些鐵離子會(huì)與需鐵蛋白結(jié)合，然后發(fā)揮后者維持細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的功能。如果無(wú)血清培養(yǎng)基中不含轉(zhuǎn)鐵蛋白，細(xì)胞內(nèi)的需鐵蛋白將無(wú)法獲得鐵離子，會(huì)失去活性，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。

維持細(xì)胞內(nèi)的鐵平衡

在細(xì)胞培養(yǎng)中，并不是鐵越多越好，而應(yīng)當(dāng)是在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間獲得適量的鐵。如果細(xì)胞內(nèi)的鐵過(guò)多，也跟細(xì)胞外環(huán)境一樣，鐵會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生破壞力極強(qiáng)的羥基自由基。而如果細(xì)胞內(nèi)鐵過(guò)少，則不足以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。轉(zhuǎn)鐵蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鐵平衡，與細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體有關(guān)。細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的數(shù)目不是固定不變的，而是隨著細(xì)胞對(duì)鐵的需求程度而上調(diào)或下調(diào)，因而可自主影響細(xì)胞對(duì)鐵的攝取量一般而言，靜止未活化的細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相對(duì)較少，而活化增殖的細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體數(shù)目顯著增加。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)中，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體數(shù)目與培養(yǎng)環(huán)境中鐵的含量也密切相關(guān)。培養(yǎng)環(huán)境中的含鐵介質(zhì)比較多，則細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的數(shù)目會(huì)減少，從而避免細(xì)胞攝入過(guò)量的鐵。

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白蛋白（HSA）

白蛋白是許多無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)的重要組成部分，例如雜交瘤或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞的系統(tǒng)。白蛋白具有多種生理功能，包括：金屬離子結(jié)合劑、自由基清除劑、滲透壓和pH值的調(diào)節(jié)劑、生長(zhǎng)因子的運(yùn)載體、表面活性劑以及營(yíng)養(yǎng)劑等。

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纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）

纖維連接蛋白添加到培養(yǎng)基中，替換或降低血清使用量，促進(jìn)細(xì)胞貼壁、遷移、移動(dòng)生長(zhǎng)、維持細(xì)胞狀態(tài)。具體作用如下：

纖維連接蛋白可以與細(xì)胞表面整合素等受體結(jié)合,促進(jìn)細(xì)胞與培養(yǎng)皿的粘附,這是細(xì)胞成功培養(yǎng)的前提。特別是一些黏附力較弱的細(xì)胞,添加纖維連接蛋白可以顯著提高其培養(yǎng)成功率。

纖維連接蛋白除了增強(qiáng)細(xì)胞附著外,還可以通過(guò)與細(xì)胞表面受體的相互作用,激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的增殖。

維持細(xì)胞形態(tài)。纖維連接蛋白與細(xì)胞結(jié)合后,可以影響細(xì)胞骨架的排列和細(xì)胞形態(tài)的維持。此作用對(duì)于某些依賴于reshape的細(xì)胞功能和分化很重要。

促進(jìn)細(xì)胞遷移。纖維連接蛋白在體內(nèi)發(fā)揮著引導(dǎo)細(xì)胞遷移的作用。在體外培養(yǎng)中可以形成化學(xué)梯度以誘導(dǎo)細(xì)胞的定向遷移,這對(duì)研究細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制很重要。

誘導(dǎo)細(xì)胞分化。不同濃度和構(gòu)象的纖維連接蛋白，可以與不同類型的細(xì)胞相互作用，展示不同的生物學(xué)效應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向分化。這在定向誘導(dǎo)多潛能細(xì)胞分化中很重要。

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