水質(zhì)對 HPLC 分析的影響
簡介：
優(yōu)化的高效液相色譜法分析需要高純度溶劑和試劑。同時，在流動相準(zhǔn)備階段，色譜柱中鹽和有機溶劑的選擇十分謹(jǐn)慎，所以水質(zhì)是非常重要的。在洗脫液中，中痕量有機物的存在可能會導(dǎo)致長期不好的結(jié)果。隨著時間推移，柱效可能會阻塞，導(dǎo)致分辨率降低，峰拖尾。大量實驗表明，水中的有機物可能影響液相色譜-質(zhì)譜分析的結(jié)果。有機污染物易電離，就會與分析物結(jié)合，從而影響實驗結(jié)果。
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研究的目的：
本研究旨在探討水質(zhì)對高效液相色譜法分析的影響。首先，使用去離子的水、 雙蒸餾水，HPLC 級別瓶裝水、 新鮮超純水和存儲超純水進(jìn)行基線比較。此外，用七種藥物混合物利用梯度的乙*與市面上的瓶裝水、新鮮純凈的水這兩種不同水質(zhì)作前處理流動相，反復(fù)進(jìn)行分析 (1310 次)，進(jìn)行色譜圖比較。
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分析方法：
1.高效液相色譜基線研究：
儀器：高效液相色譜系統(tǒng) Alliance? 2695。檢測器: PDA 模型 2996，設(shè)置在 210 nm
列: X Terra ? MS (C18，2.1 毫米 x 150 毫米 x 2.5 μ m)
流動相：高效液相色譜級乙* (J.T.Baker)，高效液相色譜級瓶裝水 (Chromanorm，Prolabo)，雙蒸水， Milli-Q Gradient A10 (Millipore)所制造的新鮮水，水凈化系統(tǒng)中在 UV 燈氧化之前所制備的水。
程序
樣品制備: 在 HPLC 分析之前 60 毫升的水樣品被富集在 X Terra MS (C18 ,4.6 x 30 毫米 x 3.5μm)
按照以下的梯度洗脫 (水: 乙*):
100%到 0%水中 30 分鐘再 80%水 10 分鐘
ESI + 實驗使用 Waters Micromass? ZQ?2000
2.藥物混合料研究:
儀器：高效液相色譜系統(tǒng): Waters 510 HPLC 色譜泵；717 加自動進(jìn)樣器；9966 光電二極管陣列，設(shè)置在
190-400 毫微米的探測器；列: SymmetryShield RP18 (Waters), 3.5 μ m，4.6 x 150 毫米。藥物混合
以下按照色譜藥品標(biāo)準(zhǔn)來自 Alltech 濃度 1 毫克/毫升，
在甲醇溶解: (1) 對乙酰氨基酚、 乙酰唑胺 (2)、Phenobarbital (3)、卡馬西平 (4)、苯妥英 (5)、 (6) 速可和萘丁美酮 (7)。混合物制備每種藥品含 0.200 μ g/m l 的。
流動相：高效液相色譜級乙* (Fisher)，HPLC 級瓶裝水 (Fisher) 和 Milli-Q Gradient A10 (Millipore)并通過 0.22 微米的 Millipak ?所制造的新鮮水以及水凈化系統(tǒng)中在 UV 燈氧化之前所制備的水。
程序
25 μ L 注射藥物混合通過 0.45 μ m 13 毫米 Millex ?-LCR 過濾裝置過濾。按照以下的梯度洗脫 (水: 乙*)
組分的混合物的分離:
80%至 30%水的 15 分鐘
30%至 80%水 1 分鐘，再進(jìn)行 80%水 4 分鐘
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水的純化：
自來水通過多種純化技術(shù)的組合生產(chǎn)出純水：
需求:用于實驗用水的超純水需要達(dá)到(電阻率是在 18.2 MW.cm25 °C) ，并且總有機碳 (TOC)包含少于 5 ppb
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結(jié)果和討論--基線研究
長久以來，雙蒸水在實驗室"黃金標(biāo)準(zhǔn)"用水，但現(xiàn)在已知它含有有機污染物: 某些污染物可能隨之水蒸汽蒸發(fā)，而某些則殘留在水中。這可能會導(dǎo)致高效液相色譜基線背景強烈。
高效液相色譜級瓶裝水還可能包含某些有機污染物 (圖 1)
通過 LC-MS，我們可以看到蒸餾水和瓶裝水中有機污染物的存在 (圖 2)。而在超純水中，紫外線光氧化是有效的消除有機物。
將一個裝有超純水的玻璃瓶暴露在實驗室中。在圖 3 可以看到污染物在水中的表現(xiàn)。超純水是一種優(yōu)良的溶劑，很容易地被實驗室大氣層中存在有機物質(zhì)所污染。
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結(jié)果和討論--藥物混合物研究
使用不同水源作為流動相利用高效液相色譜法分離 7 藥物，反復(fù)重復(fù)實驗 1310 次(圖 4)。
圖 4，以 HPLC 級瓶裝水和乙*作為流動相，在 214nm 藥物混合物色譜圖 (1) 對乙酰氨基酚、 乙酰唑胺
(2)、Phenobarbital (3)、卡馬西平 (4)、苯妥英 (5)、 (6) 速可和萘丁美酮 (7)
當(dāng) HPLC 級瓶裝的水用于制備流動相，基線漂移隨著實驗次數(shù)的增加而發(fā)生變化 (圖 5A)。而當(dāng)時使用超純水基線趨于穩(wěn)定 (圖 5B)。
基線漂移同樣出現(xiàn)在 254 nm 時采用 HPLC 級瓶裝水作為流動相 (圖 6A 和 B)。當(dāng) HPLC 級瓶裝水， 隨著時間的推移，大約在洗脫的 5 分鐘時鬼峰出現(xiàn)。(圖 6A)。而實驗超純水并沒有出現(xiàn)鬼峰(圖 6B)。
鬼峰可能是由于集中在色譜填料上的有機污染物被釋放。基線漂移可能是由于瓶裝水所釋放出的有機雜質(zhì)所帶入的。
使用新鮮帶有的很少量污染物（有機物含量很低）的超純水好于 HPLC 級瓶裝水，即使在 1310 注射后仍能提供穩(wěn)定的基線和沒有雜峰的出現(xiàn)。
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總結(jié)：
使用高效的預(yù)處理系統(tǒng)，通過 UV 光氧化處理，能有效去除水中有機雜質(zhì)，提供優(yōu)質(zhì)的超純水，相比較瓶裝 HPLC 級別瓶裝水，這種高質(zhì)量水的使用大大減少基線漂移和限制高相液相色譜法中的雜峰出現(xiàn)。使用新鮮生產(chǎn)純水且低 TOC (< 5ppb) 作為流動相有助于達(dá)到并維持良好的色譜性能。這種實驗用水非常適合于靈敏度高的方法，如液相色譜-質(zhì)譜。