Result 5: X1.1載體可以將腦內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為一個(gè)生物工廠，用于將分泌的蛋白質(zhì)輸送到大腦
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血管在腦區(qū)各個(gè)角落的分布，使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞稱為“生物工廠”成為可能。
SPARCL1/Hevin基因的下調(diào)或錯(cuò)義突變在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都有報(bào)道，如自閉癥、精神分裂癥和抑郁癥。在發(fā)育中的小鼠視覺皮層中，Hevin對于丘腦皮質(zhì)連接的形成和可塑性是特別需要的。Hevin基因敲除小鼠(Hevin KO)在出生后的前三周和成年后都表現(xiàn)出明顯的谷氨酸偶體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2陽性(VGluT2+)丘腦皮質(zhì)突觸的缺失(Figure 4E)。為了確定腦內(nèi)皮細(xì)胞異位表達(dá)Hevin是否可以挽救Hevin-KO小鼠的缺陷，作者使用AAV9-X1.1-CAG-Hevin-EGFP的載體，尾靜脈注射Hevin-KO小鼠，3周后，結(jié)果顯示：在腦內(nèi)皮細(xì)胞中，Hevin蛋白穩(wěn)健而特異性的表達(dá)(Figure 4F)。結(jié)果表明，由腦內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的Hevin能夠模擬內(nèi)源性Hevin功能，挽救Hevin-KO小鼠嚴(yán)重缺乏的丘腦皮質(zhì)突觸形成。因此，該系統(tǒng)說明了Hevin相關(guān)疾病的潛在治療策略。
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Result 6: X1載體家族在體外有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)人腦內(nèi)皮細(xì)胞
AAV9-X1感染內(nèi)皮細(xì)胞(HBMECs)在MOI為3*104時(shí)，X1轉(zhuǎn)導(dǎo)了42%的HBMEC，比親本AAV9高180倍。進(jìn)一步設(shè)計(jì)的版本X1.1和X1.2分別轉(zhuǎn)導(dǎo)了44%和53%的HBMEC。
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Result 7: X1.1有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)的獼猴和人腦切片
AAV9-X1在HBMECs中的強(qiáng)大表現(xiàn)促使我們研究它們在系統(tǒng)中的功效，該系統(tǒng)可能更好地模擬非人靈長類動(dòng)物體內(nèi)條件。因此，作者轉(zhuǎn)向體外腦切片培養(yǎng)系統(tǒng)（Figure 5B）。這些切片是從靈長類動(dòng)物（長尾獼猴，Macaca Nemestrina）的大腦中新鮮提取的，并在體外培養(yǎng)。
7-10天后，我們從組織中提取DNA和RNA，并使用下一代測序(NGS)計(jì)算組織中AAV庫中變體的富集程度。與AAV9相比，X1.1的DNA和RNA分別增加了4倍和25倍。值得注意的是，在離體腦切片中，X1.1誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)主要見于神經(jīng)元。結(jié)果說明：X1.1在獼猴和人類離體切片中的強(qiáng)勁表現(xiàn)(Figure 5F)表明，該衣殼在未來的轉(zhuǎn)化中具有巨大的潛力。
Result 8: X1.1在靜脈給藥后有效靶向恒河猴的中樞神經(jīng)系統(tǒng)
完成了AAV9-X1.1在離體NHP和人腦模型中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的驗(yàn)證后，作者進(jìn)行了猴的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。作者同時(shí)測試了AAV9-CAG-EGFP與AAV9-X1.1-CAG-EGFP，兩種載體在新生恒河猴，每只猴5E+13vg/kg，表達(dá)4周后，作者觀察到與AAV9相比，X1.1在包括皮層、舌回(LG)、海馬和小腦在內(nèi)的大腦區(qū)域有較強(qiáng)的表達(dá)(Figure 6B)，進(jìn)一步的免疫組化染色顯示，皮層中約98%的X1.1轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞是神經(jīng)元，而一小部分靶向細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞(Figure 6D、E)。X1.1的神經(jīng)元轉(zhuǎn)導(dǎo)比AAV9高約45倍(Figure 6F)。
新生獼猴中X1.1的嗜神經(jīng)譜與嚙齒動(dòng)物中X1.1的嗜內(nèi)皮細(xì)胞譜之間的差異開辟了潛在的應(yīng)用，并強(qiáng)調(diào)了跨物種分析AAV載體的必要性。這些實(shí)驗(yàn)表明，新的衣殼AAV-X1.1可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)舊大陸猴幼猴的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使其成為研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在有用載體。
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?小 結(jié)
本文講解了一款新載體AAV-X1.1，尚未搭配內(nèi)皮細(xì)胞的特異性啟動(dòng)子的時(shí)候，就已經(jīng)展現(xiàn)出強(qiáng)勁的血管內(nèi)皮細(xì)胞的精準(zhǔn)靶向性。后續(xù)的吉?jiǎng)P內(nèi)部測試中，如果新載體AAV-X1.1，搭配上特異性啟動(dòng)子（TIE或ICAM2），相信會(huì)有更好的效果。此外，作者還通過更換血清型，解決了中和抗體，影響AAV二次給藥的難題。
目前吉?jiǎng)P基因正在生產(chǎn)AAV-X1.1的試用裝，內(nèi)部測試后，將會(huì)推廣給老師們使用。
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[參考文獻(xiàn)]:
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3.sakova, A., Fehlmann, T., Keller, A. & Quake, S. R. A mouse tissue atlas of small noncoding RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 117, 25634–25645 (2020).