植物來(lái)源的細(xì)胞外囊泡是否介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)是未知的，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在抑制腫瘤的M1型和促進(jìn)腫瘤的M2型之間存在不同的極化狀態(tài)，較低的M1/M2通常與腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)。
2019年11月，南京中醫(yī)藥大學(xué)曹鵬研究員團(tuán)隊(duì)于《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》（IF= 8.676）在線發(fā)表論文“Ginseng-derived nanoparticles alter macrophage polarization to inhibit melanoma growth”，旨在研究人參來(lái)源的細(xì)胞外囊泡是否可以調(diào)節(jié)M2型極化從而促進(jìn)癌癥的免疫治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參來(lái)源的細(xì)胞外囊泡 (GDNPs) 可有效促進(jìn)M2至M1的極化，并產(chǎn)生活性氧，從而促進(jìn)小鼠黑色素瘤細(xì)胞的凋亡。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GDNP誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞極化主要依賴于Toll樣受體-4和髓樣分化因子MyD88介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。GDNPs作為哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)過(guò)程的免疫調(diào)節(jié)劑可能成為癌癥免疫療法的新型納米藥物。中科新生命參與了脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)分析工作。
Ginseng-derived nanoparticles alter macrophage polarization to inhibit melanoma growth
Journal for ImmunoTherapy of Cancer
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實(shí)驗(yàn)材料：
野生型C57BL/6小鼠、MyD88-、TLR4-和TLR2-缺陷型C57/BL6小鼠
鼠黑色素瘤細(xì)胞系 (B16F10)、乳腺癌細(xì)胞系（4T1）和人胚胎腎細(xì)胞系（HEK293T）
技術(shù)路線圖：
研究結(jié)果：
1. GDNPs的分布、穩(wěn)定性及生物相容性
通過(guò)比較BMDM、B16F10、4T1和HEK293T細(xì)胞對(duì)GDNPs的吸收率，發(fā)現(xiàn)BMDMs對(duì)GDNPs的吸收效率較高并且被吸收的GDNPs主要位于細(xì)胞質(zhì)中。作者首先評(píng)價(jià)不同給藥途徑下標(biāo)記GDNPs在生物體內(nèi)的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射以及靜脈注射72 h后，大部分GDNPs位于肝臟和脾臟中；而灌胃后的GDNPs主要位于胃腸道中。連續(xù)跟蹤體內(nèi)GDNPs，發(fā)現(xiàn)給藥7天后肝臟和脾臟中的GDNPs熒光信號(hào)仍然很強(qiáng)，這說(shuō)明納米粒子的大小和結(jié)構(gòu)增加了GDNPs在生物體循環(huán)過(guò)程中的穩(wěn)定性和保留能力。進(jìn)一步通過(guò)FACS分析發(fā)現(xiàn)，注射的GDNPs很容易被巨噬細(xì)胞吸收 (13.7%)，當(dāng)CL存在時(shí) (清除巨噬細(xì)胞)，可觀察到GDNPs的熒光信號(hào)在肝臟和脾臟中顯著降低。上述結(jié)果表明GDNPs在體內(nèi)和體外均具有向巨噬細(xì)胞的細(xì)胞趨向性。為了評(píng)估GDNPs在體外的生物相容性，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在給藥范圍內(nèi)，GDNPs在體內(nèi)和體外均無(wú)顯著的毒副作用。
圖1 巨噬細(xì)胞對(duì)GDNPs的吸收效率及評(píng)價(jià)
2. 體外實(shí)驗(yàn)：GDNPs改變巨噬細(xì)胞的M2型極化
M2型巨噬細(xì)胞占腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的絕大部分，因此，有效抑制或改變M2型細(xì)胞是癌癥治療的策略之一。因此，作者使用小鼠骨髓巨噬細(xì)胞加入IL-4和IL-13培養(yǎng)24 h使其轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>M2型細(xì)胞，隨后加入GDNPs培養(yǎng)48 h，使用流式細(xì)胞儀對(duì)極化情況進(jìn)行確證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDNPs可顯著降低M2型巨噬細(xì)胞中CD206含量，而使CD80、CD86、MHC-II和TLR2/4的表達(dá)水平顯著上調(diào)。通過(guò)對(duì)M1和M2型巨噬細(xì)胞中M1-和M2-相關(guān)基因的定量分析發(fā)現(xiàn)，GDNPs可顯著誘導(dǎo)M1相關(guān)基因而使M2相關(guān)的基因下調(diào)。同時(shí)，GDNPs可導(dǎo)致M1相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子顯著增加。上述結(jié)果表明GDNPs在體外可有效抑制巨噬細(xì)胞M2型極化。
圖2 GDNPs可抑制巨噬細(xì)胞M2型極化
3. GDNPs通過(guò)TLR4-和MyD88-途徑調(diào)控巨噬細(xì)胞極化
鑒于GDNPs所引起巨噬細(xì)胞在免疫應(yīng)答過(guò)程中的反應(yīng)與病原體引起的TLRs/MyD88信號(hào)通路相似，因此推測(cè)GDNPs的免疫調(diào)節(jié)作用是通過(guò)相似的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。在MyD88缺失型鼠中獲得M2型巨噬細(xì)胞，通過(guò)加入GDNPs培養(yǎng)48 h后發(fā)現(xiàn)M1相關(guān)的表面標(biāo)志物及相關(guān)細(xì)胞因子IL-6/TNF-α并未發(fā)生上調(diào)。與上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程類似，作者發(fā)現(xiàn)TLR2缺失型M2型巨噬細(xì)胞可以在GDNPs存在的條件下產(chǎn)生上述細(xì)胞因子，但無(wú)法在TLR4缺失型M2型巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生，該結(jié)果表明TLR4可能與GDNPs的配體相互作用從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞極化。作者同時(shí)也分析了從非藥用植物中提取的細(xì)胞外囊泡是否可發(fā)揮同樣的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從黃瓜和獼猴桃中分離得到的EVs無(wú)法將巨噬細(xì)胞極化為M1型。
4. GDNPs處理的巨噬細(xì)胞在體外抑制黑色素瘤生長(zhǎng)
為了研究GDNPs對(duì)巨噬細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞相互作用的影響，分別使用/不使用GDNPs處理M2型巨噬細(xì)胞后置換培養(yǎng)基，過(guò)48 h收集上清液培養(yǎng)基作為條件培養(yǎng)基。使用上述條件培養(yǎng)基分別處理B16F10黑色素瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未被GDNPs刺激巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理的黑色素瘤細(xì)胞相比，GDNPs刺激巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基可顯著增加黑色素瘤細(xì)胞凋亡。以往的研究報(bào)道指出總活性氧及超氧化物的含量在M1型巨噬細(xì)胞中上升，在本研究中，GDNPs處理的M2型巨噬細(xì)胞中總活性氧的含量高于未處理組，有助于M1型巨噬細(xì)胞的抗腫瘤功能。
圖3 GDNPs在體外抑制M2巨噬細(xì)胞促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)
5. GDNPs的脂質(zhì)和蛋白改變巨噬細(xì)胞極化
為了探索GDNPs中調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵組分，對(duì)GDNPs進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDNPs中二半乳糖單?；?/span> (DGMG，59.4%)、溶血腦磷脂 (PE，16.8%) 和神經(jīng)酰胺 (Cer，13.8%)含量較高。TLR4激動(dòng)劑神經(jīng)酰胺是重要的腫瘤抑制因子，在本研究中作者推測(cè)GDNPs的神經(jīng)酰胺可能通過(guò)TLR4激活途徑在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中扮演重要角色。當(dāng)使用蛋白酶消化的GDNPs處理巨噬細(xì)胞時(shí)，可檢測(cè)到少量的IL-6和TNF-α，說(shuō)明GDNPs中的蛋白質(zhì)對(duì)于其發(fā)揮抗腫瘤效果也是至關(guān)重要的。除此之外，超聲處理的GDNPs可以導(dǎo)致M2型巨噬細(xì)胞M1相關(guān)的表面標(biāo)志物以及IL-6和TNF-α顯著下調(diào)，這說(shuō)明GDNPs對(duì)于巨噬細(xì)胞極化是必須的。
為了進(jìn)一步分析巨噬細(xì)胞吸收GDNPs的途徑，作者研究發(fā)現(xiàn)LY294002可以顯著抑制GDNPs吸收，而巨胞飲抑制劑EIPA對(duì)其攝入無(wú)顯著影響，這說(shuō)明巨胞飲并非巨噬細(xì)胞攝入GDNPs的主要途徑。
圖4 與巨噬細(xì)胞極化過(guò)程相關(guān)的GDNPs組分分析
6. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：GDNPs體內(nèi)抑制小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GDNPs在體外具有將M2型巨噬細(xì)胞極化等多種抗腫瘤的作用，為了驗(yàn)證在體內(nèi)是否具有與體外同樣的作用效果，作者建立腫瘤小鼠模型 (將B16F10癌細(xì)胞皮下接種到雄性C57BL/6小鼠)，分別使用PBS或GDNPs處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDNPs可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，GDNPs處理組小鼠體內(nèi)M1型細(xì)胞數(shù)量顯著升高。通過(guò)對(duì)腹腔注射標(biāo)記GDNPs跟蹤發(fā)現(xiàn)，注射14天后，腫瘤微環(huán)境中大部分GDNPs被巨噬細(xì)胞攝入 (23.2%)。上述結(jié)果表明GDNPs可以在體內(nèi)將M2型極化為M1型，使腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞增加、腫瘤細(xì)胞死亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GDNPs抑制腫瘤生長(zhǎng)是否通過(guò)巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用，作者通過(guò)比較GDNPs處理與GDNPs+氯膦酸鹽脂質(zhì)體 (清除腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞) 處理的腫瘤小鼠模型發(fā)現(xiàn)，GDNPs+氯膦酸鹽脂質(zhì)體處理組小鼠無(wú)顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用，表明GDNPs是通過(guò)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞依賴型途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)。
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圖5 GDNPs體內(nèi)抑制黑色素瘤生長(zhǎng)
小結(jié)：
該論文作者首次證實(shí)了GDNPs可以通過(guò)TLR4和MyD88信號(hào)途徑在體內(nèi)和體外改變M2型極化，從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，因此，GDNPs可以作為哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑有望成為癌癥免疫治療過(guò)程中的新型納米藥物。
原文鏈接：https://jitc.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40425-019-0817-4；IF
