肉芽腫是免疫細(xì)胞在各種器官形成的腫塊。大多數(shù)肉芽腫看起來沒有結(jié)構(gòu)，但它們與淋巴器官有一些相似之處。為了更好地理解肉芽腫的形成，本文對(duì)結(jié)節(jié)病患者的肉芽腫進(jìn)行了原位單細(xì)胞精準(zhǔn)定量和空間轉(zhuǎn)錄多組學(xué)分析，并用生物信息學(xué)方法重建了潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
2023年2月14日，維也納醫(yī)科大學(xué)的Georg Stary團(tuán)隊(duì)在Immunity（IF=43.5）上發(fā)表了題為 “Single-cell and spatial
transcriptomics reveal aberrant lymphoid developmental programs driving
granuloma formation” 的研究論文。
本文發(fā)現(xiàn)肉芽腫中存在一個(gè)免疫刺激性環(huán)境，它重新利用了與淋巴器官發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序。肉芽腫的形成遵循特征性的空間模式，并涉及與免疫代謝、細(xì)胞因子和趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)的基因。我們確定了三種在肉芽腫形成中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞類型：代謝重編程的巨噬細(xì)胞、產(chǎn)生細(xì)胞因子的Th17.1細(xì)胞和具有炎癥和組織重塑表型的成纖維細(xì)胞。結(jié)果表明，人類肉芽腫采用了正常淋巴器官發(fā)育中具有特征性的方面，但以異常的組合方式出現(xiàn)構(gòu)成了異常的淋巴器官。
實(shí)驗(yàn)部分
本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)獲取免疫熒光圖像。獲取到圖像利用TissueQuest軟件進(jìn)行定量分析。在本文中，研究者針對(duì)TissueQuest的精準(zhǔn)識(shí)別原理做了詳細(xì)的說明。
為了研究持續(xù)性皮膚結(jié)節(jié)病患者肉芽腫（Granuloma，GA）相關(guān)細(xì)胞亞群，研究者在冰凍皮膚切片中使用免疫熒光蛋白染色技術(shù)，利用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，CD68、CD3和CD90作為細(xì)胞類型定義的表面標(biāo)記，定位真皮巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，獲得的圖像被導(dǎo)入TissueQuest 中。在軟件中，病變性皮膚切片被分為表皮和真皮區(qū)域，只有真皮區(qū)域被包含在最終分析中，去除了表皮區(qū)域；同時(shí)為了避免高自發(fā)熒光信號(hào)的干擾，大汗腺及其周邊區(qū)域也做了額外的組織去除。
在單細(xì)胞精準(zhǔn)識(shí)別的階段，使用DAPI通道先對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行識(shí)別，排除細(xì)胞碎片和黏連細(xì)胞；之后根據(jù)單細(xì)胞不同通道的染色面積，TissueQuest軟件使用核擴(kuò)張算法分割了每個(gè)細(xì)胞的真實(shí)染色輪廓。根據(jù)真實(shí)輪廓內(nèi)的染色強(qiáng)度和染色面積，設(shè)置相同的散點(diǎn)圖Cutoff閾值來確定信號(hào)強(qiáng)度，將細(xì)胞識(shí)別為“陽性”或“陰性”。
在組織識(shí)別階段，將肉芽腫結(jié)構(gòu)定義為具有一定形態(tài)且緊密的細(xì)胞聚集體，內(nèi)部有密集的CD68+巨噬細(xì)胞，其外周有強(qiáng)陽性信號(hào)的CD90+成纖維細(xì)胞，T細(xì)胞散布在巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間。繼而將目標(biāo)定量的真皮部分進(jìn)一步分為兩組：第一組包括含有肉芽腫的真皮區(qū)域，第二組包括不含肉芽腫的真皮區(qū)域。這些區(qū)域在組織原位彼此靠近，研究者使用肉芽腫外層成纖維細(xì)胞作為各自的亞分類線。每個(gè)真皮亞組輸出以下參數(shù)：每平方毫米的細(xì)胞數(shù)、感興趣標(biāo)記的平均強(qiáng)度（詳見各自圖例）和父群體的相對(duì)百分比。
巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是皮膚肉芽腫的主要細(xì)胞類型
Figure 1. 巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是皮膚肉芽腫的主要細(xì)胞類型
(E)皮膚肉芽腫的免疫熒光樣本圖像：巨噬細(xì)胞CD68(紅色；APC)、T細(xì)胞CD3(淺藍(lán)色；PE-TR)、成纖維細(xì)胞CD90(綠色；FITC)和DAPI細(xì)胞核(深藍(lán)色)。
GA巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的促炎性特征
Figure 2 GA巨噬細(xì)胞形成的肉芽腫內(nèi)部存在高度炎癥環(huán)境。
（I）免疫熒光樣本圖像表明皮膚肉芽腫中的幾丁質(zhì)酶 1（CHIT1，綠色；AF488）、CD68（紅色；APC）和 DAPI（深藍(lán)色）。
左：一例結(jié)節(jié)病肉芽腫結(jié)構(gòu)的熒光圖像。右：幾丁質(zhì)酶 1 表達(dá)的巨噬細(xì)胞（CD68+CHIT1+）的定量分析免疫熒光染色樣本結(jié)果證實(shí)了GA0巨噬細(xì)胞在肉芽腫中特異性表達(dá)幾丁質(zhì)酶1（Figure 2I）。
TissueQuest這些巨噬細(xì)胞支持適應(yīng)性免疫反應(yīng)和ECM重塑，從而有助于肉芽腫中持續(xù)炎癥的微環(huán)境。
具有Th17.1表型的T細(xì)胞富集在肉芽腫
Figure
3 具有Th17.1表型的T細(xì)胞在肉芽腫中富集。
（E）皮膚肉芽腫的CCR6（粉紅色；PE）、CD3（淺藍(lán)色；AF750）和DAPI（深藍(lán)色）的免疫熒光樣本。
Figure S3 Th17.1細(xì)胞在肉芽腫中豐富，并與巨噬細(xì)胞相互作用。
單細(xì)胞測(cè)序鑒定了7個(gè)淋巴細(xì)胞簇。簇0的輔助T細(xì)胞包括損傷性和非損傷性皮膚細(xì)胞，而簇1的細(xì)胞主要來自損傷性皮膚（Figure 4A）。因此，我們將簇0稱為穩(wěn)態(tài)輔助T細(xì)胞，將簇1稱為GA輔助T細(xì)胞。
GA輔助性T細(xì)胞似乎已經(jīng)獲得了一種慢性激活的Th17.1表型。Th17.1細(xì)胞的特征是IL-23和IL-12驅(qū)動(dòng)的從Th17向Th1表型的轉(zhuǎn)化。Th17.1細(xì)胞依賴于轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Rorγt 的聯(lián)合活性，這兩種轉(zhuǎn)錄因子確實(shí)在GA輔助性T細(xì)胞(Figure 3C)和肉芽腫皮膚(Figure 3D)中共表達(dá)。Th17.1細(xì)胞通過CCL20-CCR6軸被招募到炎癥部位，其中CCL20由髓系細(xì)胞產(chǎn)生，而其受體CCR6在T細(xì)胞上表達(dá)(圖4B)。免疫熒光樣本圖像顯示CD3+ T胞在肉芽腫內(nèi)部表達(dá)CCR6 (Figure 3E和S3F)。免疫熒光蛋白染色鑒定了CD3+ T細(xì)胞，它們既存在于肉芽腫內(nèi)，也存在于其附近（圖S3A）。
結(jié)構(gòu)細(xì)胞促進(jìn)肉芽腫局部炎癥和組織重塑
Figure 4 結(jié)構(gòu)細(xì)胞促進(jìn)肉芽腫局部炎癥和組織重塑
Figure S4 FAP標(biāo)記GA成纖維細(xì)胞并將其定位于肉芽腫結(jié)構(gòu)。
(G)皮膚肉芽腫成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP，紅色；APC)和DAPI(深藍(lán))的免疫熒光染色圖像。(H)皮膚肉芽腫的成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP，紅色；APC)、IV型膠原(ColIV，黃色；PE)和DAPI(深藍(lán))的免疫熒光蛋白染色。白色箭頭表示表達(dá)IV型膠原(ColIV)的內(nèi)皮細(xì)胞。
在成纖維細(xì)胞中，我們鑒定出三個(gè)簇（Figure 4A）。簇0主要與非病變皮膚相關(guān)，簇1主要由病變皮膚組成，而簇2包含了來自兩種來源的細(xì)胞（Figure S4D）。因此，我們將簇0稱為“穩(wěn)態(tài)成纖維細(xì)胞”，將簇1稱為“GA成纖維細(xì)胞”。
在病變皮膚中，GA成纖維細(xì)胞位于肉芽腫附近，顯示出高水平的炎癥標(biāo)志物FAP的mRNA表達(dá)（Figure 4D和S4G）。在肉芽腫外部檢測(cè)到穩(wěn)態(tài)成纖維細(xì)胞，而免疫相互作用成纖維細(xì)胞的基因特征在這些結(jié)構(gòu)附近檢測(cè)到，而組織重塑成纖維細(xì)胞主要位于肉芽腫內(nèi)部，表明ECM成分是在這些發(fā)炎的結(jié)構(gòu)內(nèi)分泌的（Figure 4D）。ECM重塑在肉芽腫中的重要性得到了進(jìn)一步的支持，因?yàn)樵诮M織重塑成纖維細(xì)胞（Figure 4D和S4H）和肉芽腫周圍的內(nèi)皮細(xì)胞（Figure S4C和S4H）中高表達(dá)了IV型膠原蛋白，以及巨噬細(xì)胞特異性mRNA表達(dá)的金屬蛋白酶（MMP9和MMP12），它們已知能降解包括IV型膠原蛋白在內(nèi)的ECM蛋白質(zhì)（Figure 4B和S4E）。基質(zhì)沉積和降解的動(dòng)態(tài)平衡可能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的遷移，同時(shí)增強(qiáng)肉芽腫內(nèi)免疫細(xì)胞的粘附和保留。
免疫和結(jié)構(gòu)細(xì)胞之間的細(xì)胞間互相作用定義了肉芽腫的結(jié)構(gòu)
Figure 5 免疫和結(jié)構(gòu)細(xì)胞之間的細(xì)胞間交流定義了肉芽腫的結(jié)構(gòu)
(C) CD68 (紅色; APC)、CD3 (淺藍(lán)色; AF750)、CD38 (黃色;PE)、CD31/PECAM1 (綠色; FITC) 和DAPI (深藍(lán)色) 對(duì)皮膚肉芽腫進(jìn)行免疫熒光染色。白色箭頭指示內(nèi)皮細(xì)胞。
(E) CD68 (紅色; APC)、CD3 (淺藍(lán)色; PE-TR)、SPP1 (淺粉色;AF750)、ITGA4 (綠色; FITC) 和DAPI (深藍(lán)色) 對(duì)皮膚肉芽腫進(jìn)行免疫熒光染色。
Figure S5 配體-受體相互作用定位于肉芽腫結(jié)構(gòu)
(C)左上角：基于受體-配體對(duì)PDL1(CD274，紅色)和PD1(PDCD1，藍(lán)色)的空間轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的基因表達(dá)。左下和右下：皮膚肉芽腫的免疫熒光蛋白染色：PD1/PDCD1(綠色；FITC)、PDL1/CD274(橙色；PE-TR)和DAPI(藍(lán)色)。
(D)皮膚肉芽腫的免疫熒光染色：PD1/PDCD1(綠色，FITC)、PDL1/CD274(橙色，PE-TR)、CD68(紅色；APC)、CD3(粉紅色；PE)和DAPI(深藍(lán)色)。左圖：放大與圖C相同的肉芽腫結(jié)構(gòu)。右圖：表達(dá)PD1的T細(xì)胞(CD3+PD1+)和表達(dá)PDL1的巨噬細(xì)胞(CD68+PDL1+)的定量。
GA巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)了許多趨化因子和趨化因子受體，預(yù)測(cè)了細(xì)胞間相互作用（例如，CXCR3與CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL19；CCR5和CCR1與CCL5；以及CCR7與CCL19）。本文還證實(shí)了前面討論過的幾種與炎癥相關(guān)的相互作用（CCR6與CCL20；GMCSFR與CSF2；以及CSF1R與CSF1），這些相互作用在空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中被觀察到，并且在肉芽腫內(nèi)顯著富集（Figure
5A,5B, 5D ）。
GA輔助T細(xì)胞表達(dá)IFNG，作用于巨噬細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞等表達(dá)IFNGR1的細(xì)胞（Figure 5A）。GA輔助T細(xì)胞還表達(dá)LTB，而相應(yīng)的受體LTBR在巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)（Figure 5A）。在淋巴器官形成過程中，LTB導(dǎo)致成纖維細(xì)胞分泌VEGF-C，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附分子的表達(dá)。在內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到PECAM1的表達(dá)，它預(yù)測(cè)了與肉芽腫中GA巨噬細(xì)胞和GA輔助T細(xì)胞的相互作用，這種相互作用被免疫熒光蛋白染色證實(shí)(Figure
5B-C)。
在肉芽腫內(nèi)觀察到PDCD1和CD274的高表達(dá)（Figure 5A），并通過免疫熒光蛋白染色確認(rèn)了相應(yīng)蛋白的共定位（Figure S5C）。肉芽腫中PD1表達(dá)的T細(xì)胞和PD-L1表達(dá)的巨噬細(xì)胞增加，與非炎癥性皮膚相比（Figure S5D），這可能隨著時(shí)間的推移導(dǎo)致肉芽腫內(nèi)T細(xì)胞的耗竭。最后，IL23和IL23R在肉芽腫中也高表達(dá)，可能有助于創(chuàng)造一個(gè)有利于Th17.1細(xì)胞表型的細(xì)胞環(huán)境。
該數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)了肉芽腫內(nèi)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞之間的密集的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)，這可能有助于促進(jìn)炎癥環(huán)境和吸引和保留驅(qū)動(dòng)結(jié)節(jié)病病理的免疫細(xì)胞。
肉芽腫與TLSs具有關(guān)鍵的共同特征
本文建立了一個(gè)12種趨化因子的TLS基因特征，發(fā)現(xiàn)它在肉芽腫中高度表達(dá)。具體來說，CCL5、CXCL9和CXCL10在GA巨噬細(xì)胞中上調(diào)，CCL4和CCL5在GA T細(xì)胞中上調(diào)，CCL5、CCL19、CXCL9、CXCL10以及CXCL11在GA成纖維細(xì)胞中上調(diào)。我們還觀察到肉芽腫特異性的CCL19-CCR7/CXCR3通路的活性，該通路涉及T細(xì)胞回歸淋巴器官。這些結(jié)果表明，肉芽腫利用了一些與TLS形成相關(guān)的相同的生物學(xué)過程。
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在本文中，研究者大量使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)和原位空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，以確定不同細(xì)胞表型及其原位分布規(guī)律，但是現(xiàn)階段原位空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)仍然無法達(dá)到單細(xì)胞分辨率下的作用關(guān)系分析，同時(shí)單一技術(shù)仍然無法解決轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和蛋白組數(shù)據(jù)的相互驗(yàn)證。Tissue
Cytometry技術(shù)作為當(dāng)前組織原位單細(xì)胞定量分析的標(biāo)準(zhǔn)之一，無論是在鑒別多熒光標(biāo)記樣本中不同蛋白表型單細(xì)胞，或是對(duì)其單細(xì)胞蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析，或是根據(jù)需要識(shí)別定量不同的組織類型，或是評(píng)估單細(xì)胞或組織的相互作用關(guān)系等應(yīng)用領(lǐng)域，均可以提供完善的解決方案。本文作者通過這兩種技術(shù)互為依托補(bǔ)充，相互驗(yàn)證，使研究的可靠性和精準(zhǔn)性得到了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
近年來，隨著對(duì)組織原位結(jié)構(gòu)微環(huán)境的解析研究不斷深入，TissueGnostics公司提出了”腫瘤亞微環(huán)境“的理念，通過解析腫瘤”癌島“之間的細(xì)胞構(gòu)成模式，探索在細(xì)胞聚類結(jié)構(gòu)中新型免疫作用中心的構(gòu)成極其意義。在這個(gè)探索中，全球頂級(jí)實(shí)驗(yàn)室的多位研究者陸續(xù)發(fā)表了腫瘤三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)相關(guān)研究，腫瘤基質(zhì)與腫瘤血管的相互作用研究等多篇論文。本文研究者也提出，通過研究證實(shí)肉芽腫在一定程度上和TLS具有相似性。相信不久以后也會(huì)有更多的研究，在利用Tissue
Cytometry技術(shù)拓展未來的研究方向。