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“在過去的一年里，人類干細胞衍生的類器官作為細胞系模型和動物模型的橋梁，已經(jīng)成為了新冠肺炎研究的有力工具【1】。”對于新冠肺炎這類呼吸性疾病的研究，最常見的體外模型是肺類器官，即：由干細胞在體外進行3D培養(yǎng)，形成包含多種組織特異的細胞類型、可以自組裝并部分模擬原生器官的結(jié)構(gòu)和功能的“微器官”。
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肺的類器官培養(yǎng)需要在體外模擬胚胎發(fā)育的過程。肺上皮來源于內(nèi)胚層，通過一系列復(fù)雜的內(nèi)胚層-中胚層介導(dǎo)的信號通路調(diào)控，經(jīng)歷內(nèi)胚層誘導(dǎo)、前-后和背-腹模式化、肺發(fā)育、肺出芽、分支形態(tài)發(fā)生，最終生成樹枝狀傳導(dǎo)氣道網(wǎng)絡(luò)（支氣管、細支氣管）和氣體交換單元（肺泡）。通過調(diào)整培養(yǎng)基的生長因子種類和含量，也可以在22天左右形成具有高度增殖能力的芽尖祖細胞類器官（bud tip progenitor organoid），這個結(jié)構(gòu)具有體外多系分化潛能和體內(nèi)移植潛能，因此芽尖祖細胞類器官是探索上皮命運決定的理想選擇。而人肺類器官（human lung organoid, hLOs）的培養(yǎng)需要大約50-85天，適用于模擬人肺發(fā)育過程中的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換。這兩種類器官都在再生醫(yī)學、組織工程和藥物安全性、有效性測試中發(fā)揮著重要作用。
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本篇文章基于Nature protocols【2】和elife【3】發(fā)表的兩篇文章，整理了人類多能干細胞（hPSCs）來源的hLOs培養(yǎng)方案。
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圖1. hPSCs來源的芽尖祖細胞類器官或hLOs培養(yǎng)方案【2】
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細胞來源
hPSCs
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培養(yǎng)基配方
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hPSCs培養(yǎng)和傳代
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1. 將凍存的Matrigel在4°C下過夜解凍，在6孔板的每孔滴加1ml冷的Matrigel，旋動6孔板使Matrigel溶液分布均勻。隨后轉(zhuǎn)移至37℃條件下孵育10min使其凝固，使用前需室溫靜置1h。
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2. 將hPSCs接種在包被Matrigel的6孔板中，每孔加入3ml mTeSR1，放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至細胞匯合度約為75-85%、且大部分無分化的狀態(tài)時，吸出培養(yǎng)基。
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3. 向hPSCs中加入1 ml Dispase（1mg/ml），并將培養(yǎng)皿放置在37℃條件下進行解離約5-10min，直到所有的細胞都以小細胞塊或單細胞的形式漂浮。
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4. 向每個孔中加入5ml的DMEM-F12，以充分稀釋Dispase。
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5. 將所有細胞轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫下300g離心3min，收集沉淀細胞。加入DMEM-F12培養(yǎng)基，以1:6的比例接種在Matrigel包被的24孔培養(yǎng)板中，向每個孔中加入0.5ml預(yù)熱的mTeSR1進行培養(yǎng)，至細胞匯合度達到45-75%。
定向分化為內(nèi)胚層和前腸球體
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6. 將24孔板內(nèi)的mTeSR1每天按照上表中第1-4天內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基組分進行換液，并將平板放回37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中。
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7. 吸出第4天內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基，替換為每孔0.5ml預(yù)熱的前腸內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基，并將平板放回37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中。在第5-9天，每天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)至第8-9天左右會形成分離的、漂浮的球狀體。
收集漂浮的前腸球體
漂浮前腸球體的收集通常在配有體式顯微鏡的層流罩或半無菌罩中進行，整個過程中需確保無菌技術(shù)和無菌環(huán)境。
8. 將含有前腸球體的24孔培養(yǎng)板置于顯微鏡下。在不破壞單層細胞的情況下，用移液器吸頭輕輕移出自由漂浮的球體，并將其轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。讓球狀體在離心管底部沉降5-10 min，必要情況下可以用微量離心機低速離心10s。
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9. 將吸出的球體接種于200μl 含蛋白濃度8.0mg/ml的Matrigel膠中，輕輕吹打混勻，迅速操作并防止氣泡產(chǎn)生。
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10. 在24孔板的每個培養(yǎng)孔中心接種25μl 混合液，放入37℃培養(yǎng)箱中靜置10min。待Matrigel凝固后，加入0.5ml hLOs培養(yǎng)基或芽尖祖細胞類器官培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
A、培養(yǎng)hLOs
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11A. 向各孔中加入0.5ml hLOs培養(yǎng)基，確保完全覆蓋Matrigel液滴。每3-5天換液一次。
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12A. 如果類器官出現(xiàn)腔中積攢了細胞碎片，或下沉到Matrigel的底部，則用移液管輕輕刮培養(yǎng)孔底部，以解離含有類器官的Matrigel。
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13A. 用移液器將Matrigel液滴和周圍的培養(yǎng)基一同吸出，并放置于顯微鏡下，輕輕去除舊的Matrigel，小心不要切到組織。隨后將新的類器官轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，吸去所有培養(yǎng)基。
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14A. 向離心管中添加200μl新鮮的Matrigel，混合均勻后在24孔板的每個培養(yǎng)孔中心接種50μl 混合液，目的是在每個孔內(nèi)植入1-3個類器官。待Matrigel在37℃培養(yǎng)箱中靜置10min凝固后，加入0.5ml hLOs培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
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15A. 每2-3周重復(fù)步驟12A-14A。一旦前腸球體被置于Matrigel中，大約需要50天可以形成具有基底細胞、粘液分泌細胞、纖毛細胞，以及肺間充質(zhì)細胞類型和原始肺泡細胞類型包圍的假復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)。隨著時間的推移，培養(yǎng)60-85天的類器官狀態(tài)最佳。
B、生成芽尖祖細胞
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11B. 向各孔中加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養(yǎng)基，確保完全覆蓋Matrigel液滴。每3-5天換液一次。
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12B. 如果類器官出現(xiàn)腔中積攢了細胞碎片，或下沉到Matrigel的底部，則用移液管輕輕刮培養(yǎng)孔底部，以解離含有類器官的Matrigel。
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13B. 用移液器將Matrigel液滴和周圍的培養(yǎng)基一同吸出，并放置于顯微鏡下，輕輕去除舊的Matrigel，小心不要切到組織。
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14B. 隨后將新的類器官轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，高速（約6000g）離心3-5s，或低速（約300g）離心3min。離心后，上皮碎片將沉降到底部，Matrigel繼續(xù)懸浮在培養(yǎng)基中，細胞團沉積在離心管底部。
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15B. 在顯微鏡下用移液器取出培養(yǎng)基和Matrigel，向沉淀的細胞團內(nèi)添加200μl新鮮的Matrigel，混合均勻后在24孔板的每個培養(yǎng)孔中心接種25μl 混合液。待Matrigel在37℃培養(yǎng)箱中靜置10min凝固后，加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
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16B. 每2-3天按照步驟12B-15B進行傳代。
培養(yǎng)芽尖祖細胞類器官
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17B. 在芽尖祖細胞培養(yǎng)約2周后，會形成一個幾乎均質(zhì)的芽尖祖細胞群體。向各孔中加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養(yǎng)基，確保完全覆蓋Matrigel液滴。每3-5天換液一次。
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18B. 如果類器官出現(xiàn)腔中積攢了細胞碎片，或下沉到Matrigel的底部，則用移液管輕輕刮培養(yǎng)孔底部，以解離含有類器官的Matrigel。
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19B. 用移液器將Matrigel液滴和周圍的培養(yǎng)基一同吸出，并放置于顯微鏡下，輕輕去除舊的Matrigel，小心不要切到組織。隨后將新的類器官轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，吸去所有培養(yǎng)基。
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20B. 向離心管中添加200μl新鮮的Matrigel，混合均勻后在24孔板的每個培養(yǎng)孔中心接種50μl 混合液。待Matrigel在37℃培養(yǎng)箱中靜置10min凝固后，加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
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由于含有芽尖祖細胞，在類器官周圍的芽尖內(nèi)部會出現(xiàn)SOX2+氣道狀結(jié)構(gòu)，可以分化為粘液分泌細胞。粘液和細胞碎片通常會聚集在類器官的腔中，因此需要在顯微鏡下將這些光學致密、顆粒狀的雜質(zhì)去除。
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21B. 將Matrigel轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的DMEM-F12培養(yǎng)皿中，用無菌手術(shù)刀將類器官切成兩半。取1ml注射器吸滿DMEM-F12，輕輕推出培養(yǎng)基，沖洗類器官中的粘液等雜質(zhì)。
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圖2.hLOs和芽尖祖細胞類器官的生長模式【2】
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hLOs主要由肺的上皮和間葉部分組成，其結(jié)構(gòu)特征與天然肺相似。利用RNA測序，Dye, B. R.et al.【3】發(fā)現(xiàn)hLOs與人類胚胎肺在全球轉(zhuǎn)錄譜上非常相似，這表明hLOs是研究人類肺發(fā)育、成熟和疾病的一個極好的模型。
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圖3. hLOs和人胚胎肺的相關(guān)性很高【3】
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類器官作為一種研究模型，在發(fā)育生物學、疾病病理學、細胞生物學、再生機制、精準醫(yī)療以及藥物毒性和藥效試驗等方面潛力巨大。但是，類器官培養(yǎng)技術(shù)建立過程中會面臨多種挑戰(zhàn)。為了更輕松更高效的建立類器官培養(yǎng)技術(shù)，歡迎各位掃碼加入類器官培養(yǎng)交流群，在這里會有專業(yè)的技術(shù)支持人員幫您解惑答疑，也將定期分享類器官前沿進展，讓類器官培養(yǎng)更簡單！
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推薦產(chǎn)品-肺類器官培養(yǎng)
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相關(guān)產(chǎn)品：
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參考文獻：
【1】VAN DER VAART, Jelte, et al. Advancing lung organoids for COVID-19 research. Disease Models & Mechanisms, 2021, 14.6: dmm049060.
【2】MILLER, Alyssa J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature protocols, 2019, 14.2: 518-540.
【3】DYE, Briana R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. elife, 2015, 4: e05098.
蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應(yīng)用解決方案的高新技術(shù)企業(yè)，主營業(yè)務(wù)為靶點及細胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發(fā)、生產(chǎn)和銷售，并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)。公司定位為醫(yī)療健康與生命科學領(lǐng)域原料與技術(shù)解決方案的上游供應(yīng)商，致力于為下游客戶提供及時、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品及服務(wù)，助力全球生物醫(yī)藥企業(yè)和研究機構(gòu)的技術(shù)與產(chǎn)品創(chuàng)新升級。
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