?一、鑒定目的蛋白表達(dá)
1、挑單菌落在氨芐(Amp，終濃度為 100g/mL)的 4mL?LB 培養(yǎng)基中 37℃，250rpm 過夜培養(yǎng)。
2、將過夜培養(yǎng)菌液以 1:100 轉(zhuǎn)接于含上述抗生素的 100mL??LB 中，37℃，250rpm，3.5h（培養(yǎng)至 OD600＝0.6 左右）。
3、取出 1 mL 菌液為未誘導(dǎo)的電泳對(duì)照，剩余培養(yǎng)液加入誘導(dǎo)物 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 4h。
4、以未誘導(dǎo)菌液與 IPTG 誘導(dǎo)后菌液作對(duì)比，SDS-PAGE 檢測(cè)。
二、蛋白表達(dá)是上清還是沉淀（而不是可溶不可溶，無論是上清沉淀均為可溶）
1、將上述的 37℃誘導(dǎo)菌液離心（4℃，12000g，5min），棄 上清（LB 培養(yǎng)液），沉淀重懸于 0.9% NaCl 溶液洗菌。
2、將重懸于 0.9% NaCl 的菌體溶液離心（4℃，12000g，5min），棄上清（0.9% NaCl 洗菌液），得菌體，稱菌體重量，重懸于 8mL PBS（pH 7.0）緩沖液，緩沖液用量根據(jù) 50~100mg/mL 的菌液終濃度。
3、超聲破菌：冰浴條件下，超聲波破碎大腸桿菌，超聲設(shè)置如下功率：400W，工作：15s，間隔：45s，全程時(shí)間：30min（30 次左右）以菌液由白變透
明，且不粘稠為依據(jù)（少量菌液用液氮反復(fù)凍融 7 次以上效果也不錯(cuò)，而且簡(jiǎn)單，但是 DNA 出來后會(huì)粘稠，可能加 dna 酶后會(huì)好些，那樣好離心，我是用接近最高轉(zhuǎn)速離心的（沒加 dan 酶），不然分不開）4、將超聲波破碎的菌液離心 （4℃，12000g，15min），分別收集上清和沉淀，各取 1mL，
加入 1mL 2×上樣緩沖液，沸水浴 10min，SDS-PAGE 檢測(cè)。
三、探索蛋白表達(dá)系統(tǒng)可溶表達(dá)條件
有上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，目標(biāo)蛋白在上清也有表達(dá)，即存在可溶性的表達(dá)，但是量很少，大部分也包涵體的形式存在（沉淀中），而包涵體的存在也證明了蛋白質(zhì)表達(dá)量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都優(yōu)于對(duì)包涵體蛋白的分離純化，所以可通過探索可溶表達(dá)條件，最終來加大上清蛋白的含量，以利于下一步實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
影響包涵體形成的因素有很多，如誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)時(shí)間，IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 濃度，搖床轉(zhuǎn)速等等，所以設(shè)定在低 IPTG 濃度下（0.1 mmol/L），在不同溫度，誘導(dǎo)時(shí)間下的表達(dá)對(duì)照：
1）37℃ 250rpm 5h
2）30℃ 180rpm 10h
3）23℃ 90rpm 30h
過程：挑取一單菌落接種于含氨芐(Amp，終濃度為 100g/mL)的 3mL 液體 LB 培養(yǎng)基中 37℃，
250rpm 培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)菌液以 1:100 轉(zhuǎn)接于含上述抗生素的 50mL+50mL+60mL 液體 LB 中，37℃，250rpm，3.5h（大量培養(yǎng)至 OD600＝0.6 左右）。從 60mL 培養(yǎng)液中取 10mL 作為未誘導(dǎo)對(duì)照，標(biāo)記 3 個(gè) 50mL LB 培養(yǎng)菌液：1、37℃ 250rpm 5h 2、30℃ 180rpm 10h 3、 23℃ 90rpm 30h都分 5 次取樣：37℃ 每一小時(shí)取樣一次（取 10mL）編號(hào)為：371、372、373、374、375 30℃ 每二小時(shí)取樣一次（取 10mL）編號(hào)為：301、302、303、304、305 37℃ 每五小時(shí)取樣一次（取 10mL）編號(hào)為：231、232、233、234、235
誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，將上述樣品分別破菌離心，得上清與沉淀，加 2× 上樣緩沖液，沸水浴
10min，SDS-PAGE 檢測(cè)。
聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)
四、大量制備，蛋白表達(dá)與純化
五、更多蛋白表達(dá)資料可訪問德泰生物蛋白表達(dá)專題（http://www.detaibio.com/topics/dan-bai-biao-da.html）
配置 1L LB 液體培養(yǎng)基，分裝成 100mL×10 瓶，分瓶以利于大腸桿菌生長(zhǎng)和后續(xù)操作。誘導(dǎo)培養(yǎng)：挑取一單菌落接種于含氨芐?(Amp，終濃度為?100g/mL)的?3mL×5?管 液體?LB?培養(yǎng)基中 37℃，250rpm 培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)菌液以 1:100 轉(zhuǎn)接于含上述抗生素的 100mL×10 瓶液體 LB 中，37℃，250rpm，3.5h（大量培養(yǎng)至 OD600＝0.6 左右）。取出 1 mL 菌液為未誘導(dǎo)的電泳對(duì)照，剩余培養(yǎng)液加入誘導(dǎo)物 IPTG 至終濃度為 0.1 mmol/L，23℃，90rpm 條件下，繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 20 小時(shí)。
破菌收集上清：分別離心（4℃，12000g，5min）加?8mL×10?管?PBS（pH 7.0）緩沖液重懸后，冰浴條件下超聲波破碎（400W，15s，45s，30min），分別離心（4℃，12000g，15min）收集上清（8mL 左右×10 管）。
稀釋過濾上清：將?8mL?左右×10?管菌液用?PBS（pH 7.0）緩沖液稀釋為?2?倍，并過?0.45?納米濾膜。取 1mL 留樣。
過鎳柱純化：（8mL?左右×10?管×2?倍=160mL，分?2?次過柱，每次?80mL）
A、用緩沖液 I （PBS pH 7.0 緩沖液）平衡鎳柱，5個(gè)床體積，流速為 2mL/min。
B、B、將稀釋過濾后的上清上樣，流速為 1mL/min。
C、用緩沖液 I （PBS pH 7.0 緩沖液）再洗 5 個(gè)床體積，流速為 2mL/min。使目標(biāo)蛋白充分掛柱。
D、用含 50mM 咪唑的緩沖液 III，洗去雜蛋白，流速為 2mL/min。并收集洗雜峰。E、用含 100mM 咪唑的緩沖液 III，進(jìn)行洗脫，流速為 1mL/min。并收集洗脫峰，收集洗脫液。
F、將收集的洗脫液用 15mL 超濾離心管分次超濾濃縮，收集各次濃縮液合并后再次超濾濃縮，分裝成每管 1.5mL，取 1mL 4℃?zhèn)溆茫溆?80℃保存。
G、各取 1mL 過柱前、掛柱穿透、洗雜液、洗脫液加 2×上樣緩沖液，沸水浴 10min，SDS-PAGE檢測(cè)。