小編常常收到老師們的問題：我想做測序，我想做蛋白組學(xué)……但是我的樣本不夠啊，不符合你們的送樣標(biāo)準(zhǔn)，這可怎么辦!!!!
別著急小編今天就給大家介紹兩種絕對定量測序：UMI mRNA-seq和UMI miRNA-seq，完美解決樣本量不夠的問題，順便還能得到比常規(guī)測序更精準(zhǔn)的結(jié)果，大家一起來了解一下。
什么是絕對定量測序
UMI(Unique Molecular Identifier)分子標(biāo)記則通過隨機(jī)性利用不同的分子標(biāo)簽，標(biāo)記和區(qū)分不同的分子。絕對定量轉(zhuǎn)錄組測序（UMI-seq）通過在文庫擴(kuò)增前為每一條逆轉(zhuǎn)錄的 cDNA 添加的分子標(biāo)簽UMI，使同一個片段擴(kuò)增出來的產(chǎn)物均帶有相同的標(biāo)簽，天然重復(fù)片段則帶有不同的標(biāo)簽。利用 UMI 過濾數(shù)據(jù)，可一比一準(zhǔn)確還原樣本初始狀態(tài)。UMI標(biāo)記測序的結(jié)果與Q-PCR檢測結(jié)果一致性高，甚至對于低豐度表達(dá)的基因也能較準(zhǔn)確的測出
UMI 標(biāo)記方式示意圖[1]
被隨機(jī)分子標(biāo)簽標(biāo)記的 cDNA 分子，在PCR擴(kuò)增、建庫測序及后續(xù)分析過程中都攜帶著這個獨特的 UMI 標(biāo)簽。分析的時候計數(shù) UMI 的個數(shù)，通過去重的辦法去掉由于PCR偏好性多余擴(kuò)增的UMI分子數(shù)，可以完美還原原始組成中不同RNA分子的比例，可實現(xiàn)原始RNA 分子的 “絕對定量”。
UMI絕對定量示意圖
絕對定量測序（UMI-seq）的產(chǎn)品優(yōu)勢
一、更低的樣本量，建庫起始量低，mRNA-seq只需50ng，miRNA-seq只需200ng的Total RNA就能順利進(jìn)行mRNA/small RNAseq，更適合量少與珍貴樣品；
二、更準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果，差異基因與Q-PCR驗證一致性更高,極大縮短實驗?zāi)繕?biāo)篩選時間。據(jù)文獻(xiàn)報道，普通RNA-seq和miRNA-seq與Q-PCR驗證的相關(guān)性為70%和35%，使用UMI建庫，相關(guān)性可以達(dá)到80%以上；
Q-PCR法測定已知量UMI與實際測試UMI量的相關(guān)性[3] Q-PCR驗證UMI miRNA差異基因分析[3]
三、更穩(wěn)定的定量分析結(jié)果，避免低豐度基因丟失，可為致病及易感基因篩選等提供精準(zhǔn)分析；
普通文庫實際定量與模擬定量計算的相關(guān)性和穩(wěn)定性[2] UMI文庫實際定量與模擬定量計算的相關(guān)性和穩(wěn)定性[2]
四、可區(qū)分天然重復(fù)和擴(kuò)增重復(fù)的區(qū)別，準(zhǔn)確識別可變剪切事件。
絕對定量測序（UMI-seq）測序方案
測序平臺：illumina Novaseq 6000
測序模式：PE150
絕對定量測序（UMI-seq）生信分析內(nèi)容
UMI mRNA-seq分析流程
UMI miRNA-seq分析流程
絕對定量測序（UMI-seq）的應(yīng)用范圍
比較轉(zhuǎn)錄組
要求精準(zhǔn)的序列信息，從表達(dá)水平反應(yīng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)化的動態(tài)變化，并尋找潛在的驅(qū)動基因變化。
個體機(jī)制
要求準(zhǔn)確的mRNA、smallRNA差異基因分析，構(gòu)建miRNA及其靶基因的相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
互作轉(zhuǎn)錄組
寄生類RNA表達(dá)豐度較低，可通過增加PCR循環(huán)次數(shù)提高檢出率同時保證準(zhǔn)確性。
生物標(biāo)志物
適用于起始量較低或者富集較困難樣本。
【參考文獻(xiàn)】
1.S. Mangul, et al. UMI-Reducer?: Collapsing duplicate sequencing reads via Unique Molecular Identifiers. bioRxiv, 2017 pp. 1–11.
2.Katsuyuki Shiroguchi, Tony Z. Digital RNA sequencing minimizes sequence dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. PNAS. 2012, 109: 1347-1352.
3.Pieter Mestdagh,Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control(miRQC) study. Nature Methods. 2014, 29.