大多數(shù)分子的基因表達與蛋白質(zhì)豐度密切相關(guān)，但蛋白質(zhì)功能和最終的生物學(xué)結(jié)果還受翻譯后修飾所調(diào)節(jié)的。盡管單細胞測序技術(shù)（scRNA-seq）已經(jīng)可以深度到單細胞水平，然而蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)仍達不到。空間細胞分選策略在一定程度上可以克服這些限制，同時保留了組織的空間分辨率。
近期，德國海德堡德國癌癥研究中心血管腫瘤和轉(zhuǎn)移分部的研究者在Cell旗下的《Developmental Cell》（IF：10.1，中科院JCR 1區(qū)）上發(fā)表題為“A spatial vascular transcriptomic, proteomic, and phosphoproteomic atlas unveils an angiocrine Tie–Wnt signaling axis in the liver”的研究成果。該研究巧妙地利用空間細胞分選策略，完成了對肝小葉內(nèi)皮細胞的空間轉(zhuǎn)錄組、空間蛋白組和空間蛋白磷酸組學(xué)分析，為該方向的研究提供了有效的、具有廣泛適用性的實驗設(shè)計。同時，作者也發(fā)現(xiàn)了一條重要的Tie-Wnt信號軸，對促進肝再生具有關(guān)鍵作用。
肝臟內(nèi)皮細胞的空間多組學(xué)實驗設(shè)計和總體結(jié)果的展示
作者通過分析已發(fā)表的肝內(nèi)皮細胞（L-EC）scRNA-seq中的表面分子表達情況，并通過流式細胞術(shù)分析獲得了不同L-EC亞群，且保持L-ECs空間坐標(biāo)的能力，分別為門靜脈結(jié)節(jié) [PN]、門靜脈周圍[PP]、中央周圍 [PC]和中央靜脈 [CV]。
作者在每個分群中共準(zhǔn)備了4個生物學(xué)重復(fù)（每個生物學(xué)重復(fù)來自于30個小鼠肝內(nèi)皮細胞），并將這些樣本進行了mRNA-seq、label-free蛋白質(zhì)以及Label-free磷酸化蛋白質(zhì)檢測。總體分析結(jié)果展示如下：
1. 轉(zhuǎn)錄組、蛋白組及磷酸蛋白組分別檢測到28727個基因、5015個蛋白和3447個蛋白上的19607個蛋白磷酸化位點（下圖G）。
2. 磷酸化幾乎都發(fā)生在絲氨酸（S）、蘇氨酸 (T)和酪氨酸 (Y)殘基上，占比分別為76.7%、20%和3.3%（下圖G）。通過比較四個群體的差異表達，定義了所有肝內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)錄物、數(shù)千個蛋白質(zhì)和相應(yīng)的磷酸化位點的分帶模式，建立了一個全面的蛋白質(zhì)表達和磷酸化的空間多組學(xué)圖。
轉(zhuǎn)錄組分區(qū)顯示了獨特的肝內(nèi)皮細胞特征
轉(zhuǎn)錄組RNA seq共檢測到了超過28000個基因，在可進行定量分析的13737個基因中，共有4943個基因在表達模式上有明顯的分區(qū)特征。整體來說，對肝內(nèi)皮細胞群體進行空間分類，能夠?qū)⒁郧皢渭毎麥y序定義的分區(qū)的空間分辨率提高了一個數(shù)量級，同樣的以分區(qū)的形式揭示了大約三分之一的可量化的肝內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)錄物。
蛋白豐度的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控
每個基因只有表達了合適的蛋白量才能正常發(fā)揮功能，蛋白豐度受到合成和降解的調(diào)控。一般認為轉(zhuǎn)錄組可以反映蛋白組。基于這樣的假設(shè)，作者從結(jié)果中共找到4169個蛋白-mRNA對。雖然總體上，RNA和蛋白呈現(xiàn)正相關(guān)，但不同基因有不同的蛋白表達和RNA表達，一些相似豐度的RNA其蛋白表達量可能有高達1000倍的差異，這反應(yīng)了蛋白合成和/或降解程度上的差異。這種蛋白和RNA表達的差異性就體現(xiàn)在蛋白/轉(zhuǎn)錄本比率上（protein-transcript ratio， PRT）。總體呈現(xiàn)一種向高PRT偏移的高斯分布，而高PRT蛋白數(shù)量是低PRT蛋白的3倍（下圖C）。核糖體相關(guān)的蛋白占了低PRT蛋白中很大一部分，而高PRT蛋白中很多是參與到代謝和生物合成過程等。PTR值的差異表明，不同的核糖核酸翻譯效率或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性可能是肝竇蛋白質(zhì)分帶的主要調(diào)節(jié)機制。
空間蛋白組學(xué)揭示沿著肝臟血管有不同的磷酸化分布
接下來分析了蛋白質(zhì)表達沿肝竇的空間分布。發(fā)現(xiàn)有25%的蛋白是沿著肝小葉軸分區(qū)表達的（下圖A）。同時，磷酸化基序分析確定了116個保守基序。大約8%的蛋白質(zhì)具有顯著的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，這導(dǎo)致蛋白質(zhì)和核糖核酸之間的不同表達模式。約16%檢測到的磷酸化蛋白具有顯著分區(qū)變化，這表明磷酸化狀態(tài)的空間梯度是沿著肝竇的肝內(nèi)皮細胞功能特征的主要決定因素。
酪氨酸磷酸化顯著富集中央靜脈區(qū)
為了進一步表征蛋白質(zhì)磷酸化的空間排列，我們分析了3個主要磷酸化位點的分布。各分區(qū)絲氨酸磷酸化和蘇氨酸磷酸化的分布大致相等，但酪氨酸（p-Y）磷酸化則相對較嚴(yán)格的富集在中央靜脈區(qū)（CV）（下圖A）。不同磷酸化的空間占比分析更是直觀地表明，在CV中有大量的磷酸化酪氨酸（D&E）。作者分析前述的scRNA-seq發(fā)現(xiàn)，受體酪氨酸激酶（RTK）是在肝內(nèi)皮細胞中表達豐度最高的激酶家族，而RTK磷酸化主要發(fā)生在中央靜脈區(qū)。總體，這一部分分析發(fā)現(xiàn)，肝小葉中磷酸化活性有明顯分區(qū)特點，中央靜脈區(qū)（CV）有顯著的受體酪氨酸激酶活性。
中央靜脈區(qū)酪氨酸激酶Tie1的磷酸化塑造了L-EC分區(qū)，同時產(chǎn)生了Wnt9b梯度
作者進一步聚焦具體的受體酪氨酸激酶（RTK），其中血管生成素受體Tie1和Tie2/TEK是高度分區(qū)表達的磷酸化蛋白。用Tie1-39對小鼠進行全身治療 ，2h后檢測基因的表達情況，在中央靜脈區(qū)比門靜脈結(jié)節(jié)的差異更顯著。最值得注意的是，心血管標(biāo)志物基因Wnt9b的表達幾乎完全關(guān)閉，這表明Tie受體信號是血管Wnt表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。STAT3促進Wnt9b轉(zhuǎn)錄，而FoxO1作為Wnt9b轉(zhuǎn)錄阻遏物。
Tie1誘導(dǎo)的Wnt對肝再生是必需的
作者進一步分析了Tie1-Wnt9b信號軸對肝再生的作用。作者構(gòu)建了在內(nèi)皮細胞中條件沉默Tie1的小鼠模型，并追蹤在切除小鼠2/3肝臟2天后的肝再生情況（下圖A&B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt9b和Wnt2這兩個在肝內(nèi)皮細胞中表達的Wnt 配體的表達顯著降低，而其他非特異表達的Wnt配體的表達量則未發(fā)現(xiàn)顯著差異（下圖C）。Wnt靶基因——Axin2 和 Tbx3的表達也顯著下調(diào)（下圖D&E）。相似地，兩個預(yù)示肝臟祖細胞高增殖能力的基因——Sox9 和 Lgr5的表達也顯著下調(diào)（下圖F&G），產(chǎn)生的結(jié)果就是，肝再生顯著受阻，在肝切除手術(shù)2天后，小鼠的肝重/體重值下降(下圖H)。總體來看，這些結(jié)果表明了Tie1信號依賴的Wnt生成是保持肝再生以及肝損傷后恢復(fù)肝質(zhì)量的關(guān)鍵決定因素。
結(jié) 論
1.作者基于單細胞測序（scRNA-seq）的空間分選方法可以進行肝血管系統(tǒng)的多組學(xué)解析研究。
2.酪氨酸磷酸化富集在中央靜脈區(qū)。
3.Tie1- Wnt信號軸對肝再生具有關(guān)鍵促進作用。
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