神秘的重復(fù)序列（來自 Ishino, Y , et al. 1987）

此后，西班牙和荷蘭等各地科學(xué)家也陸續(xù)在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)新的重復(fù)序列，并發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列和間隔序列的排列方式、重復(fù)序列重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)都可以表現(xiàn)出很大差異。因此Ruud Jansen在2002年將具有以上特征的DNA片段命名為CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列），但依舊無法解釋它的作用。

直到2005年，西班牙微生物學(xué)家Francisco Mojica發(fā)表的文章才揭開了這些序列的真實身份：他證實CRISPR間隔序列匹配噬菌體DNA，提出其作為細(xì)菌“免疫記憶庫”的假說。細(xì)菌通過將病毒DNA片段嵌入自身基因組，形成“分子通緝令”，當(dāng)相同病毒再次來襲時，便能精準(zhǔn)識別并摧毀入侵者。這一發(fā)現(xiàn)開啟了基因編輯的新紀(jì)元！

2011年，Emmanuelle Charpentier團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的核心組分：crRNA（由CRISPR轉(zhuǎn)錄而來）與tracrRNA（反式激活crRNA）結(jié)合，指導(dǎo)Cas9蛋白切割目標(biāo)DNA。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)（來自Emmanuelle Charpentier，2012）

2012年，Jennifer Doudna與Emmanuelle Charpentier在《Science》發(fā)表載入基因編輯史冊的里程碑研究：她們將復(fù)雜的CRISPR系統(tǒng)簡化為Cas9蛋白+sgRNA 的二元組合，開發(fā)了第三代基因編輯工具——CRISPR/Cas9技術(shù)。只需修改sgRNA的20個堿基序列，就能引導(dǎo)Cas9精準(zhǔn)切割任意DNA靶點。更因此獲得了2020年的諾貝爾化學(xué)獎！

（來自諾貝爾獎官網(wǎng)）

次年，張鋒發(fā)表了利用CRISPR技術(shù)實現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞基因編輯的文章，標(biāo)志著CRISPR技術(shù)從理論到實踐的一大飛躍。后續(xù)科學(xué)家們的不斷深入探索研究，CRISPR技術(shù)逐漸完善，正朝著基因編輯的時代邁進(jìn)。

CRISPR系統(tǒng)的本質(zhì)是RNA引導(dǎo)的DNA切割引擎，其納米級精準(zhǔn)性源于三大核心組件的精密協(xié)作：

當(dāng)這些組件協(xié)同工作時，將啟動四步精密機制：

1.組裝：Cas9與sgRNA結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP）；

2.掃描：sgRNA通過堿基互補配對在基因組中搜尋目標(biāo)；

3.解鎖：Cas9識別PAM序列（NGG）后解旋DNA雙鏈；

4.切割：Cas9蛋白的HNH結(jié)構(gòu)域切斷互補鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域切斷非互補鏈。獲得斷裂的雙鏈DNA（DSB）。

CRISPR/Cas9技術(shù)原理

切割后的DNA修復(fù)路徑如下：

路徑1：非同源末端連接（NHEJ），生物體內(nèi)自發(fā)的SOS修復(fù)，修復(fù)期間會導(dǎo)致片段的插入或缺失。

路徑2：同源定向修復(fù)（HDR），引入高度同源的DNA修復(fù)模板時會啟動，實現(xiàn)片段的定向插入。

第三代技術(shù)相比于ZFNs和TALENs前兩代技術(shù)更有優(yōu)勢，實驗設(shè)計難度降低、操作流程簡便、脫靶率低，細(xì)胞毒性低（如使用純蛋白RNP體系進(jìn)行基因編輯）。但依舊有脫靶風(fēng)險，當(dāng)sgRNA與非目標(biāo)序列部分匹配時，Cas9可能誤切關(guān)鍵基因（如癌癥相關(guān)基因）。不過基因編輯研發(fā)并未止步，2023年，CRISPR基因編輯藥物Casgevy上市，據(jù)2025年5月數(shù)據(jù)顯示90%以上的鐮狀細(xì)胞病患者實現(xiàn)“功能性治愈”；2024年，中國科學(xué)家更發(fā)現(xiàn)VII型CRISPR系統(tǒng)（Cas14），首次實現(xiàn)僅靶向RNA而不改變DNA序列的精準(zhǔn)編輯，為基因治療開辟更安全的路徑。相信在未來CRISPR技術(shù)將更加精進(jìn)，運用于個性化的精準(zhǔn)醫(yī)療，造福人類。

隨著CRISPR技術(shù)從實驗室走向產(chǎn)業(yè)化，標(biāo)準(zhǔn)化工具鏈的完善成為推動臨床與農(nóng)業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵。針對基因編輯全流程的痛點——從Cas蛋白、sgRNA設(shè)計、Cas蛋白遞送到脫靶驗證，近岸蛋白已開發(fā)出覆蓋全鏈條的解決方案：

01 純蛋白編輯工具：Cas9（Cat.No.:E365）蛋白及其突變體，同時包含GMP級別的Cas9蛋白（Cat.No.:GMP-1701）、0脫靶的AaCas12b^Max、enCas12Ultra等蛋白；

02 通用型一步法sgRNA制備：sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Cat.No.:E399）在20μl體系下sgRNA產(chǎn)量可達(dá)10-30μg；

03 高效RNP遞送系統(tǒng)：首先在體外將sgRNA和Cas9蛋白混合成為sgRNA和Cas9的復(fù)合效應(yīng)物，然后通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)（脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)等）將復(fù)合效應(yīng)物遞送到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而實現(xiàn)對靶基因的編輯（相關(guān)實驗操作可后臺咨詢近岸蛋白公眾號）；

04 脫靶驗證：T7核酸內(nèi)切酶I有效檢測基因編輯之后形成的突變體，識別切割效率高。

以上便是基因編輯技術(shù)從ZFNs、TALENs到CRISPR/Cas9三代技術(shù)的進(jìn)化史詩。而CRISPR革命的核心引擎——Cas蛋白家族，實則暗藏更精妙的分子江湖：下期我們將帶您深入CRISPR武器庫，解析不同Cas蛋白的PAM偏好、切割特性與應(yīng)用場景，助您精準(zhǔn)匹配研究需求。

作為深耕基因編輯領(lǐng)域的專業(yè)解決方案提供者，近岸蛋白將持續(xù)推出技術(shù)解析、實操指南與定制化工具，陪伴每一位科研工作者探索生命密碼的無限可能。敬請期待，下期再會！