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逆轉(zhuǎn)錄實驗做不好，是不是引物出了問題
實驗室常用到的實驗：逆轉(zhuǎn)錄實驗
實驗人員通過體外模擬病毒復(fù)制過程，以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄酶催化，合成出與RNA互補的cDNA鏈。最終構(gòu)建cDNA文庫，并從中篩選所需的靶標基因。
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BUT！小伙伴們做逆轉(zhuǎn)錄實驗時，
1）有沒有深究過RNA逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA能不能真實反映出基因表達信息？
2）做實驗時，有沒有發(fā)生過內(nèi)參做的很好，目的基因做不出的情況？
如果有發(fā)生上述情況，那么需要重新評估逆轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)果的有效性。
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逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果有效性的評定
逆轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)果有效性的評定最重要的是盡可能反映樣本中原始RNA模板的信息，即均一性地將RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。理論上來講，不考慮堿基組成的影響，均一性體現(xiàn)在不同位置處的片段同等效率地合成cDNA，進而保證真實地反映轉(zhuǎn)錄譜中不同基因的實際豐度。
逆轉(zhuǎn)錄實驗的成功與RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物及反應(yīng)程序等有關(guān)。當我們實驗做不成功時，大家會優(yōu)先從模板、逆轉(zhuǎn)錄酶來找原因，往往忽略引物在其中起的作用，其實引物對逆轉(zhuǎn)錄成敗也至關(guān)重要。
今天小翊就跟大家討論下逆轉(zhuǎn)錄引物的分類和選擇。
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逆轉(zhuǎn)引物的分類和選擇
逆轉(zhuǎn)錄引物有三類，Oligo dT引物、隨機引物、基因特異性引物（GSP，Gene Specific Primer）。
1）Oligo dT引物：
若干dTTP組成的引物，可以和真核生物mRNA的Poly A尾配對，與模板結(jié)合特異性高。因該特異性，常適用于獲取轉(zhuǎn)錄本靠近3’末端序列。它不適用于降解的RNA模板，也不適用于缺少A尾的RNA，如原核生物RNA和miRNA。當RNA模板降解時或RNA內(nèi)部中有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)時，會造成cDNA合成長度變短，無法有效合成靠近RNA 模板5’末端的序列。這是影響均一性的常見因素。
也常見Oligo dT序列的3’端存在幾個錨定堿基，如常見的miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄引物。
2）隨機引物
隨機引物是若干個堿基組成的寡核苷酸，如隨機六聚體，5’-d（NNNNNN）-3’，是各種引物的混合物。它與模板結(jié)合的特異性低，可在整個轉(zhuǎn)錄本的多個位點退火，產(chǎn)生短的、部分長度的cDNA。常適用于獲取轉(zhuǎn)錄本5’末端序列及二級復(fù)雜結(jié)構(gòu)的區(qū)域。一般不建議用于長片段序列的合成。有文獻報道15個堿基的隨機引物比6堿基和9堿基隨機引物轉(zhuǎn)錄出的cDNA產(chǎn)量和基因豐度更高[1]
3）基因特異性引物（GSP）
基因特異性引物（GSP）也即是反向引物，是與模板序列互補的引物，需要實驗者根據(jù)實驗需求自己設(shè)計合成，適用于目的序列已知的情況。若做一步法RT-PCR，只能用GSP引物。設(shè)計GSP的原則同PCR引物相同。
若研究真核基因時，可將Oligo dT與隨機引物混合使用，集二者之長，得到的cDNA均一性更好。實驗重復(fù)性也更高。
對三種引物有初步了解后，針對一些實驗中遇到的問題，小翊給大家提供了實驗建議。
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實驗建議
問題一：大鼠肝臟的RT-qPCR，逆轉(zhuǎn)錄用的是oligo dT引物，PCR時內(nèi)參出的很好，就是目的基因不出，已經(jīng)差不多一個月了。怎么辦？
小翊建議：根據(jù)Oligo dT引物介紹，具有明顯二級結(jié)構(gòu)的RNA也會破壞全長cDNA的合成，造成RNA 5’末端的代表性下降。同樣的，RNA模板出現(xiàn)降解時，也會造成Oligo dT全長cDNA合成能力的下降。建議使用Oligo dT/隨機引物的混合物作為逆轉(zhuǎn)錄啟動引物。
問題二：RNA模板有降解怎么辦？
小翊建議：盡量選用RNA質(zhì)量好的樣本，但是如果條件不允許，建議用隨機引物，適合poly A比較短或被降解的情況做逆轉(zhuǎn)錄。
問題三：RNA病毒研究用什么引物？
小翊建議：在ＲＮＡ病毒的研究中一般用隨機引物和基因特異性引物。一方面是病毒RNA沒有ＰolyＡ的原因。另一方面，當復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)較多時，使用基因特異性引物有利于提高退火溫度，打開二級結(jié)構(gòu)，合成較長的cDNA片段。
好啦,逆轉(zhuǎn)錄引物的介紹就到這里啦,期望對小伙伴的實驗有所幫助。
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參考文獻
[1] Stangegaard M1, Dufva IH, Dufva M.Reverse transcription using random pentadecamer primers increases yield and quality of resulting cDNA[J].Biotechniques,2006 May,40(5):649-57.
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