三步搞定外泌體實驗
近幾年，外泌體以迅雷不及掩耳之勢火了起來。外泌體相關(guān)研究逐漸從小眾走向大眾，受到越來越多的關(guān)注，涌現(xiàn)了一大批的外泌體課題。
但大家還是感覺外泌體研究 好 難 啊！為什么呢？首要原因就在于該領(lǐng)域里還木有統(tǒng)一的、簡單可行且純度很高的分離方法。每一個外泌體研究者都注定要為外泌體的分離純化與鑒定而煩惱。今天小編就來給大家聊一聊，如何搞定外泌體研究中的第一步。
超速離心法:
超速離心法是外泌體分離最常見的技術(shù)之一。據(jù)不完全統(tǒng)計，約有1/2的研究者會選擇該種方式分離外泌體。該方法由幾個離心步驟組成，可分步去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大囊泡，沉淀外泌體（如圖所示）。但該種方法用于血漿和血清等粘性生物液體時效率較低，且重復(fù)離心操作有可能對外泌體造成損害，從而降低其質(zhì)量。
如將超速離心配合蔗糖溶液進(jìn)行梯度密度離心可得到純度更高的外泌體，是公認(rèn)可以得到最高純度的分離方法。但此法對離心時間非常敏感，一般需要8-30h，產(chǎn)率較低，同樣不適用于血漿和血清等粘性生物液體中外泌體的分離，因此難以廣泛普及。
聚合物沉淀法:
第二大主流的外泌體分離技術(shù)就是基于聚合物的沉淀法了，最常見的聚合物是聚乙二醇（PEG）。通常將含有聚合物的沉淀溶液與生物體液混合，4℃溫育，低速離心，沉淀外泌體（如圖所示）。目前已有成熟的PEG-base商業(yè)試劑盒，比如圖中的ExoQuick?（System Biosciences）。這類試劑盒使用容易和快速，不需要額外的設(shè)備，且隨著產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代，提取效率和純化效果逐漸提高，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來。沉淀法的主要缺點是分離物中會有少量的聚合物存在。不過大家不用擔(dān)心，一般來說這些物質(zhì)不會干擾下游分析，使用商業(yè)試劑盒提取外泌體也受到越來越多雜志的認(rèn)可。
外泌體的鑒定是繼分離后又一個困擾研究者的問題。如果大家看過外泌體研究相關(guān)的文獻(xiàn)，就肯定對一張圖印象深刻。
不錯，想發(fā)外泌體文章，光找到高效率的分離方法還不夠，要過的第二關(guān)就是證明你分離得到的就是外泌體。鑒定方式不外乎就是下面這三種：1. 形態(tài)學(xué)（電鏡）；2. 粒子大小（徑粒分析）；以及3. 標(biāo)志蛋白（WB）。綜合來說，透射電鏡可以清楚的看到外泌體的大小、形態(tài)等，屬于鑒定方法中的金標(biāo)準(zhǔn)，其他兩種方式則常常作為輔助使用。
得到了外泌體之后如何做？
外泌體攜帶大量功能性的miRNA，少量的mRNA、lncRNA，以及特異性的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞因子、生長因子）等生物活性物質(zhì)，在體內(nèi)參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)程密切相關(guān)。對外泌體驗明正身之后，就可以在蛋白水平和核酸水平對其進(jìn)行檢測和深入分析了。
此處要注意，由于外泌體中含有較多降解的短RN**段，測序時會成為背景干擾有效數(shù)據(jù)，通常都建議使用芯片的方法檢測外泌體miRNA。而對于lncRNA來說，大部分在細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)，在外泌體中豐度就更低了，對于低豐度基因，芯片檢測的準(zhǔn)確性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于測序（想知道為啥的，參見前期的文章：基因芯片 vs RNA-seq哪個好？），因此也建議使用基因芯片的方法檢測外泌體lncRNA。
現(xiàn)在大概了解外泌體研究大概要怎么做了吧？那么如何用外泌體發(fā)表高分文章呢？我們也給大家準(zhǔn)備好套路啦。想看的戳這里。
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