肝細胞負責(zé)糖異生、尿素循環(huán)、藥物代謝等關(guān)鍵代謝，是肝臟的主要功能細胞。肝功能衰竭直接導(dǎo)致代謝性肝病。但目前為止缺乏能夠重現(xiàn)代謝功能的原代人肝細胞（PHH）模型。

傳統(tǒng)的肝細胞“三明治培養(yǎng)法”無法實現(xiàn)肝細胞的長期擴增，而基于小分子抑制劑的培養(yǎng)法可能引起膽管分化（即“脂肪變性”，高功能性細胞被重編程為具有增殖能力的細胞）。現(xiàn)有的類器官培養(yǎng)技術(shù)可從小鼠成體肝細胞和胎兒肝母細胞中獲得體外3D自組織模型，擁有與來源組織近似的分子特性與結(jié)構(gòu)組成，但缺乏確保成體PHH長期擴增同時保留生理功能的培養(yǎng)方案。

2025年4月16日，日本慶應(yīng)義塾大學(xué)醫(yī)學(xué)院Toshiro Sato團隊在頂刊Nature上發(fā)表論文“Generation of human adult hepatocyte organoids with metabolic functions”，首次成功開發(fā)了一種能夠長期維持人成年肝細胞代謝功能的類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，克服了人成年肝細胞在體外培養(yǎng)中面臨的長期自我更新與代謝功能的復(fù)刻兩大難題，在基因編輯和疾病建模中具有強大潛力。

研究團隊首先使用癌癥基因組圖譜 (TCGA) 數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，WNT、Ras、TGFβ、STAT3和PKA等信號通路的改變與肝細胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，他們設(shè)計了一種包含EGF、HGF、FGF-10、Wnt/R-spondin、TGFβ家族抑制劑（A83-01和Noggin）、IL-6和PKA激活劑（forskolin）的培養(yǎng)基，用于促進肝細胞的長期擴增。

實驗結(jié)果表明，這種擴增培養(yǎng)基能夠高效地形成表達肝細胞標志物（如白蛋白和HNF4α）的小囊狀類器官（人肝細胞類器官，HHOs）。獲得的HHOs能夠在體外長期培養(yǎng)，且在形態(tài)上與肝細胞相似，表現(xiàn)出良好的增殖能力。

戒斷篩選實驗顯示，Wnt/R-spondin、EHF、TGFβ抑制劑和IL-6是生長支持因子。Noggin和forskolin則對長期穩(wěn)定性至關(guān)重要。需要注意的是，肝內(nèi)膽管細胞類器官(ICOs) 生長速度較快，可能與HHOs爭奪生態(tài)位，因此需要根據(jù)形態(tài)學(xué)進行人工去除。

圖1：基于細胞因子的HHOs的擴增

以上培養(yǎng)基可維持HHOs擴增2-3個月，但其增殖速度在1個月左右已經(jīng)開始減慢。有鑒于IL-6（一種可激活STAT3的細胞因子）可以促進HHOs增殖，研究人員篩選了同類激活因子，發(fā)現(xiàn)oncostatin M（OSM）對細胞擴增的作用最強。

OSM可驅(qū)動HHO的上皮樣基底極性，同時與富含層粘膠蛋白的細胞外基質(zhì)（Matrigel）相互作用，共同促進HHOs增殖（以指數(shù)方式繁殖至少3個月，并在6個月內(nèi)保持其生長）。此外，OSM還維持了其肝細胞特性，防止了導(dǎo)管化生。

圖2：OSM-STAT3促進HHOs的穩(wěn)定擴增

除OSM外，研究人員接下來發(fā)現(xiàn)，YAP信號也通過不同的機制誘導(dǎo)HHO擴增，但這種刺激并非不可或缺。阻斷YAP信號對HHO增殖的影響很小。不過，由LATS抑制劑（LATSi）激活的YAP協(xié)同增強了HHO與OSM的增殖，導(dǎo)致類器官在3-4周內(nèi)增殖超過一百萬倍。另一方面，YAP和TGFβ靶基因還可能促進導(dǎo)管化生（膽管細胞樣特征的出現(xiàn)）。而OSM則能夠阻斷YAP信號活性、抑制限制肝細胞增殖的TGFβ靶基因的表達，從而促進肝細胞擴張并防止導(dǎo)管化生。

以上結(jié)果表明，LATSi與OSM可以協(xié)同促進HHOs增殖最大化。

在使用更昔洛韋治療的肝細胞衰竭的TK-NOG小鼠中，來自于年輕供體（2歲以下）的HHOs比原始PHH顯示出更高的定植效率。

如前所述，LATSi處理使HHO在3周內(nèi)擴增百萬倍，但導(dǎo)致再生效率下降，這表明累積增殖阻礙了再生潛力，這可能與擴增過程中端粒縮短有關(guān)。

圖3：HHOs在小鼠體內(nèi)的肝臟再生

在擴增培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究人員進一步優(yōu)化了分化培養(yǎng)基，通過去除細胞因子OSM、WNT/R-spondin及Noggin、引入激素（生長激素、催乳素和皮質(zhì)醇）和γ分泌酶抑制劑（DAPT）的混合物，成功誘導(dǎo)HHOs分化為具有代謝功能的成熟肝細胞類器官（dHHOs）。

圖4：具有代謝功能的dHHOs的建立

主成分分析（PCA）顯示，dHHOs具有與PHH整體轉(zhuǎn)錄組的相似性。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析也顯示，dHHOs具有與PHH代謝功能相關(guān)的基因表達模式，包括膽汁酸分泌、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、藥物代謝、糖異生和尿素循環(huán)等。

具體而言，與擴增HHO（eHHO）相區(qū)別，dHHO 中存在微管系統(tǒng)，可合成膽汁酸、并產(chǎn)生甘油三酯（無論是否補充 Wnt/R-spondin）。在長期擴增（超過90天）中，HHO中的甘油三酯生成能力和脂質(zhì)積累保持完好，證明其具有肝細胞特異性的脂質(zhì)代謝。

dHHO還具有重現(xiàn)藥物吸收和代謝的能力，可用于藥物在肝細胞中的毒性評估。此外，dHHOs還能夠進行糖異生和尿素循環(huán)，這在體外培養(yǎng)的肝細胞模型中是難以實現(xiàn)的。其甚至具備產(chǎn)生血漿白蛋白的能力（生成率為每百萬細胞 50 至 150 μg 天^-1，與人體內(nèi)的估計生成率每百萬細胞 37-105 μg 天^-1相當），也是長期培養(yǎng)的人肝細胞模型的重大突破。

圖5：dHHOs的代謝特征

對PHH進行基因工程改造可以增進對肝臟疾病的了解，但此前相關(guān)工作一直存在挑戰(zhàn)。本文中，研究人員建立了HHO 的基因編輯工作流程，解決了電穿孔效率低、基因工程改造后的生長停滯和導(dǎo)管化生三個難題，改良了電穿孔條件，并加入LATSi和人血小板裂解物以使基因編輯的類器官有效擴增，與此同時并不會出現(xiàn)早期生長停滯。

總而言之，HHOs可以作為一種穩(wěn)定且可操作的基因編輯平臺，用于研究肝臟疾病和開發(fā)治療策略。

圖6：基因敲除的HHOs

本研究開發(fā)的系統(tǒng)首次實現(xiàn)了人成年肝細胞的體外長期自我更新，并同時保持了其代謝功能，克服了以往培養(yǎng)方法的局限性。

HHOs在基因編輯和疾病建模方面的成功應(yīng)用也為研究肝臟疾病的分子機制和開發(fā)新的治療策略提供了有力的工具。

參考資料

1. Igarashi, R., Oda, M., Okada, R. et al. Generation of human adult hepatocyte organoids with metabolic functions. Nature (2025).