以新型藥物遞送系統(tǒng)為支撐的高端制劑是當(dāng)今醫(yī)藥領(lǐng)域重要的新藥研發(fā)方向，其中AAV因?yàn)榘踩院?、宿主范圍廣、靶向性強(qiáng)被作為基因遞送的工具被廣泛使用。免疫細(xì)胞具有對炎癥組織固有的趨向性，在藥物靶向遞送的方面潛力巨大，已逐漸成為研發(fā)的熱點(diǎn)。參與非特異性免疫反應(yīng)的細(xì)胞主要是吞噬細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，還有自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）。參與特異性免疫反應(yīng)的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。關(guān)于AAV在免疫細(xì)胞中的靶向策略一直是大家關(guān)注的重點(diǎn)方向，接下來小編將從注射方式和實(shí)例分析兩個部分，分成上下兩期給大家進(jìn)行講解。
免疫細(xì)胞不同的注射方式：
用AAV靶向免疫細(xì)胞的策略有三種：直接分離感染原代細(xì)胞；體外感染細(xì)胞再回輸；免疫細(xì)胞體內(nèi)靶向注射。直接分離和感染原代細(xì)胞主要是針對T細(xì)胞；體外感染細(xì)胞再回輸策略是指從血液中分離免疫細(xì)胞，體外培養(yǎng)用AAV感染之后再輸送至體內(nèi)。用AAV為載體的CAR-T和CAR-NK細(xì)胞療法本質(zhì)就是一種體外靶向再回輸?shù)牟呗裕幻庖呒?xì)胞靶向注射就是用不同的方式注射AAV去定向感染免疫細(xì)胞。
小鼠T細(xì)胞分離步驟：
收集小鼠淋巴結(jié)：淋巴結(jié)通常位于小鼠的頸部、腋窩和腹股溝等部位。使用無菌手術(shù)器械，將淋巴結(jié)取出并放入含有PBS的離心管中；
制備單細(xì)胞懸液：將小鼠淋巴結(jié)放入含有PBS的離心管中，用無菌剪刀和注射器將淋巴結(jié)切碎，加入含有胰酶和DNA酶的消化液中。將混合物在37℃下消化1-2小時，然后使用無菌過濾器篩選出單細(xì)胞懸液；
分離T細(xì)胞：將單細(xì)胞懸液放入離心管中，加入含有T細(xì)胞抗體的磁珠，并在磁力架上進(jìn)行分離。T細(xì)胞抗體能夠識別并結(jié)合T細(xì)胞表面的特定蛋白質(zhì)，從而將T細(xì)胞與其他細(xì)胞分離開來。將T細(xì)胞分離后，使用流式細(xì)胞術(shù)或顯微鏡觀察T細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量；
培養(yǎng)T細(xì)胞：將分離出的T細(xì)胞放入含有營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)。
體外感染細(xì)胞再回輸[1]：
針對體外感染細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞。
體外分離巨噬細(xì)胞步驟：
腹腔巨噬細(xì)胞被分離成單細(xì)胞，在腹腔內(nèi)注射6ml冷的PBS，然后瀅注射器和針頭吸出4ml腹腔液，分離出單細(xì)胞懸浮液；
肝臟灌注之后解剖肝臟和肺部，將其切碎，用500μg/ml膠原酶和400μg/ml的DNA酶在37℃消化30min;
組織通過100μm的過濾器清洗兩次；
肝臟進(jìn)一步在33%離心機(jī)中進(jìn)行進(jìn)一步處理，700g，15min；
紅血球細(xì)胞裂解出來，制備單細(xì)胞懸浮液。
針對免疫細(xì)胞的體內(nèi)靶向注射：
針對免疫細(xì)胞的注射方式有尾靜脈注射、頸靜脈注射、門靜脈注射、氣管內(nèi)注射、肌肉注射等
門靜脈注射核心步驟[2]：
暴露門靜脈：
對小鼠腹部從膀胱到劍突骨區(qū)域做一個2.5cm的皮膚切開；
使用同樣的方式打開腹部的肌肉層，使用組織拉鉤將打開的皮膚和肌肉固定在左右兩側(cè)；
將腸子移動到無菌紗布上并反轉(zhuǎn)胰腺暴露出門靜脈，門靜脈位于胰腺的底部。
病毒注射：
當(dāng)門靜脈暴露后，向胰腺的門靜脈下方2mm處入針；
緩慢的將注射器中的超純AAV病毒注入血管；
注射完成后，用棉簽按壓30s,將腸子放回腹腔，縫合皮膚。
氣管內(nèi)注射[3]：
暴露氣管：
將麻醉好的小鼠取出仰臥放置在手術(shù)板上，用醫(yī)用膠布固定小鼠四肢并用皮筋穿過門齒固定在手術(shù)板上，使其嘴端朝向操作者并呈45°夾角，在小鼠鼻孔上方放置連通氣體麻醉系統(tǒng)的軟管，確保整個實(shí)驗(yàn)過程中小鼠處于穩(wěn)定麻醉狀態(tài)；
在小鼠頸部上方放置一強(qiáng)光源（如fiber - lite?高強(qiáng)度光纖柔性光源，Dolan-Jenner Industries, MA United States），使得氣管、食管等組織可視化；
用不銹鋼的彎頭鉗輕輕地將小鼠的舌頭拉出至嘴的一側(cè)并保持，以便直接看到會厭和喉頭；
將鈍頭的90°彎曲的不銹鋼鑷子深入到舌下，將舌頭小心提起以便可以清楚的看到并進(jìn)入氣管，微調(diào)至?xí)捛逦梢姡ㄈ绻饩€不足可調(diào)整頸部上方光源位置）；
用慣用手將套管針置于食指和中指之間，用拇指穩(wěn)定套管，引導(dǎo)套管經(jīng)口和喉頭進(jìn)入氣管，至氣管分叉處立即停止前進(jìn)，迅速移除金屬導(dǎo)絲，在套管的末端連接氣體麻醉系統(tǒng)導(dǎo)管，確保持續(xù)通氧氣及異氟烷；
病毒注射：
吸取適量病毒，待小鼠穩(wěn)定時，短暫移去麻醉系統(tǒng)導(dǎo)管，使用移液器將病毒注入套管使小鼠吸入；
再將氣體麻醉系統(tǒng)導(dǎo)管與套管相連，維持5~10min；
對于AAV在不同免疫細(xì)胞中的靶向策略，我們吉凱基因也在收集相關(guān)資料整理成冊，方便各位老師的查閱參考。下表是針對不同免疫細(xì)胞的注射方式，各位老師可以快速查詢自己感興趣的免疫細(xì)胞。
具體細(xì)胞類型 | 注射方法 |
單核/巨噬細(xì)胞 | 尾靜脈注射 |
體外感染細(xì)胞，回輸小鼠 | |
頸靜脈 | |
門靜脈（肝巨噬細(xì)胞Kupffer） | |
氣管內(nèi)注射（肺巨噬） | |
T細(xì)胞 | 肌肉注射 |
腹腔注射 | |
直接分離培養(yǎng)原代T細(xì)胞 | |
B細(xì)胞 | 靜脈注射 |
淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞 | 肌肉注射 |
樹突狀細(xì)胞 | 體外感染細(xì)胞，皮下注射小鼠 |
肌肉注射 |
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參考文獻(xiàn)…
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