編者按
知母 (Anemarrhena asphodeloides Bge., AAB) 是一種傳統(tǒng)藥用植物，在延緩衰老方面有著悠久的歷史。然而，其多糖的抗衰老作用尚未得到充分研究。
今天，我們分享2024年12月27日發(fā)表在INT J BIOL MACROMOL（IF=7.7）的一項最新研究成果，該研究首次利用斑馬魚、細胞等多種模型探究了知母多糖（AABP）的抗衰老活性，并發(fā)現(xiàn)一種葡甘聚糖AABP-1a，為深入研究知母抗衰老機制提供了理論基礎(chǔ)。
AABP-1a 的分子量 (MW) 測定為 210.062 kDa，主要由葡萄糖和甘露糖組成，摩爾比約為 4:1。研究表明，AABP-1a 具有抗氧化能力，并能改善由衰老標志物，如 p53、p21、p16 和 SASP介導的細胞周期停滯，減少受損DNA的積累。它能降低斑馬魚體內(nèi)酸性衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性，延長秀麗隱桿線蟲的壽命，并減少脂褐素的表達。
文章題目
Structural characterization and anti-aging activity investigation of a polysaccharide from Anemarrhena asphodeloides Bge
雜志：International Journal of Biological Macromolecules（IF=7.7）
發(fā)表時間：2024年12月27日
01、研究亮點
• 首次探究了知母多糖 (AABP) 的結(jié)構(gòu)和抗衰老活性，并采用斑馬魚、體外細胞、秀麗隱桿線蟲等多種模型系統(tǒng)驗證了AABP-1a的抗衰老作用，發(fā)現(xiàn)其在多種模型中均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗衰老效果；
• 首次從知母中分離出具有顯著抗衰老活性的葡甘聚糖AABP-1a，并通過FT-IR分析、剛果紅試驗、掃描電子顯微鏡（SEM）分析、甲基化分析、核磁共振譜分析等多種技術(shù)詳細表征了其結(jié)構(gòu)；
• 揭示了AABP-1a通過其抗氧化能力、調(diào)控細胞周期關(guān)鍵通路，如p53/p21、p16以及抑制 SASP等多重作用機制協(xié)同發(fā)揮抗衰老效果，為天然、安全、有效的抗衰老候選分子的開發(fā)提供了科學依據(jù)。
02、研究背景
細胞衰老，即由DNA損傷、端粒縮短或氧化應(yīng)激等引發(fā)的一種細胞周期永久停滯的狀態(tài)，現(xiàn)已成為生物學和老年醫(yī)學領(lǐng)域的核心議題。近年來，科學界對揭示細胞衰老機制的關(guān)注度日益提升。值得注意的是，細胞停止分裂與釋放衰老相關(guān)分泌表型(SASP)密切相關(guān)，SASP表型可能會通過影響周圍組織來促進衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。
在抗衰老領(lǐng)域，盡管已開發(fā)出二甲雙胍、雷帕霉素和β-煙酰胺單核苷酸（NMN）等合成化合物用于延緩衰老及預防相關(guān)疾病，但其長期使用可能伴隨著肝毒性、視網(wǎng)膜功能障礙等副作用。因此，對安全有效的天然抗氧化劑的需求日益增長，以延緩衰老并降低衰老相關(guān)疾病風險的發(fā)生。
生物活性多糖因其在免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤生長、抗病毒、降低氧化應(yīng)激水平、降血糖等方面的治療特性，已成為全球研究熱點，尤其是多糖的抗衰老作用，引起全球?qū)W者的廣泛關(guān)注。研究表明，多種植物多糖具有顯著的抗衰老作用，其中具有突出抗衰老功效的葡甘露聚糖成為了重點研究對象。
本研究以百合科植物知母（AAB）為研究對象，其廣泛分布于中國，以清熱瀉火、滋陰潤燥的功效而著稱。知母富含甾體皂苷、生物堿、雙苯吡酮、木脂素、多糖、氨基酸、揮發(fā)油等多種成分，其中多糖約占其根莖成分的30%。盡管知母中的皂苷相關(guān)藥理研究備受關(guān)注，但其多糖的結(jié)構(gòu)與藥理潛力尚未被充分挖掘。
本研究中，研究人員首次從知母中分離純化出抗衰老成分——葡甘聚糖AABP-1a，全面闡明了其結(jié)構(gòu)，并通過斑馬魚、細胞、秀麗隱桿線蟲等多種模型系統(tǒng)驗證了AABP-1a的抗衰老作用，初步闡明了AABP-1a的抗衰老機制，表明其通過抗氧化與細胞周期調(diào)節(jié)等協(xié)同發(fā)揮抗衰老作用，為AABP-1a在抗衰老領(lǐng)域的產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
研究結(jié)果顯示，AABP-1a的分子量 (MW) 為210.062kDa，主要由葡萄糖和甘露糖組成，其摩爾比約為4:1。AABP-1a 的主鏈主要由→4)-2Ac-\β-Man(1→ 和→4)-\β-Glc(1→ 以及少量支鏈→4,6)-\β-Glc(1→和→3,4)-\β-Glc(1→構(gòu)成，支鏈部分由→6)-\β-Glc(1→ 和 t-\α-Glc(1→ 組成。AABP-1a 具有抗氧化能力，并能改善由衰老標志，如p53、p21、p16 和 SASP介導的細胞周期停滯，減少受損DNA的積累。此外，它能降低斑馬魚體內(nèi)SA-\β-Gal的活性，延長秀麗隱桿線蟲的壽命并減少脂褐素 (lipofuscin) 的表達。
03、研究結(jié)果
1. 多糖的提取、純化、分餾及單糖組成
知母通過水提和初步純化，獲得12.31%的多糖（AABP）。從AABP中分離得到中性多糖(AABP-1)及3種酸性多糖，AABP-1的回收率為33.14%。隨后，進一步純化中性多糖AABP-1，獲得2種中性多糖AABP-1a和AABP-1b。使用AABP-1a(210.062kDa)來表征其結(jié)構(gòu)并分析其生物活性，并通過BCA法定量檢測AABP-1a的蛋白含量極低，僅有0.27%。采用間羥基聯(lián)苯法測定AABP-1a不含酸性多糖。
單糖組成分析表明，AABP-1a由甘露糖(Man)和葡萄糖(Glc)組成，其摩爾比為4:1，這表明AABP-1a是一種葡甘聚糖，而甘露糖是構(gòu)成AABP-1a的主要單糖。
圖1
2. AABP-1a的結(jié)構(gòu)表征
研究人員首次通過FT-IR分析、剛果紅實驗、掃描電子顯微鏡（SEM）分析、甲基化分析、核磁共振譜分析等多種技術(shù)詳細闡明了AABP-1a的精細結(jié)構(gòu)。多種技術(shù)分析顯示，AABP-1a 的主鏈主要由O-乙酰化的→4)-\β-Manp-(1→和→4)-\β-Glcp-(1→ 組成；支鏈包含少量 →4,6)-\β-Glcp-(1→ 和 →3,4)-\β-Glcp-(1→；支鏈末端由 →6)-\β-Glcp-(1→ 和 t-\α-Glcp-(1→ 構(gòu)成。
剛果紅實驗證實，隨著NaOH溶液的濃度從0升高到0.4摩爾/升，AABP-1a可觀測到整個光譜范圍內(nèi)的紅移現(xiàn)象，這表明AABP-1a具有穩(wěn)定的三重螺結(jié)構(gòu)表征。SEM分析顯示，在5000x的放大倍率下，其具有疏松多孔的纖維狀形態(tài)。
圖2
3. AABP-1a在體外的抗氧化活性
自由基，又稱游離基，由單個不配對電子的原子、分子、離子或基團組成，被認為是細胞衰老的關(guān)鍵因素。它們的高反應(yīng)性可以與細胞成分，如DNA、脂質(zhì)和其他分子等相互作用，引起氧化損傷并促進多種疾病的發(fā)生。具有較高自由基清除率的化合物有望延緩細胞及組織的衰老。
研究表明，AABP-1a具有強大的自由基清除能力，且AABP-1a在特定濃度范圍內(nèi)，對DPPH和羥自由基的清除效率與濃度有關(guān)。值得注意的是，在10mg/mL的濃度下，AABP-1a對DPPH自由基的清除率為54.92%，對羥自由基的清除率為67.72%，這表明它具有顯著的抗氧化特性。
4. 斑馬魚揭示AABP-1a對SASP、SA-β-gal及細胞周期分布的影響
衰老相關(guān)分泌表型(SASP)，即細胞在衰老過程中呈現(xiàn)的一種與年齡相關(guān)的分泌表型。隨著細胞老化，會生成種類繁多的細胞因子、細胞外基質(zhì)成分及其他生物活性分子，這些分子在調(diào)節(jié)細胞環(huán)境、參與與鄰近細胞、免疫細胞和內(nèi)皮細胞的相互作用中起著重要的作用，從而影響周圍組織的功能和狀態(tài)。為了研究AABP-1a 對常見 SASP 事實的潛在影響，研究人員采用qRT-PCR實驗檢測了IL-6、IL-1B、MMP3、EMGB1和 RANTES的MRNA表達。結(jié)果表明，AABP-1a可以在斑馬魚抗衰老模型中顯著逆轉(zhuǎn)SASP的表達(p<0.05)，AABP-1a可能具有抗炎特性、減緩衰老相關(guān)過程、增強細胞微環(huán)境等多種作用，并可能在減緩與衰老相關(guān)的變化、提升機體整體健康水平和功能方面起到一定作用。
圖3
SA-β-gal在細胞衰老過程中起著關(guān)鍵作用，其常與SA-β-gal活性增加有關(guān)。作為細胞衰老的經(jīng)典指標，它被用來表征細胞的衰老狀態(tài)。研究中，SA-β-gal表達的顯著升高表明斑馬魚抗衰老模型的成功建立。采用不同濃度的AABP-1a進行處理后，SA-β-gal表達的指數(shù)顯著降低(p<0.001)。為了進一步驗證實驗結(jié)果的可信度，研究人員還研究了斑馬魚抗衰老模型中，AABP-1a對SA-β-gal染色的影響。結(jié)果顯示，這些指標的趨勢與細胞模型中觀察到的趨勢完全一致(圖3G、I)，這進一步證實了AABP-1a的抗衰老作用。
細胞老化的一個顯著特征是細胞周期停滯。當生長停止時，由于顯性細胞周期抑制劑的表達，細胞無法啟動DNA復制。在本研究中，研究人員探究了AABP-1a對細胞周期的影響。結(jié)果顯示，79.4%的H_2 O_2誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）處于G0/G1期，而只有7.57%處于S期。相比之下，未處理的細胞中G0/G1期和S期的比例分別為55.48%和30.8%，這表明HUVECs的細胞周期停滯在G0/G1期。AABP-1a預處理顯著降低了G0/G1期細胞的比例，M劑量66.6%(圖3H)，由此可以推測AABP-1a可能通過改善周期阻滯來達到抗衰老效果。
5. AABP-1a對秀麗隱桿線蟲的影響
隨著細胞老化，壽命是線蟲老化過程中最直觀的評價指標。研究人員探究了不同劑量的AABP-1a對秀麗隱桿線蟲壽命的影響。結(jié)果顯示，在500ug/mL濃度下，AABP-1a可使秀麗線蟲的存活率提高8.69%(圖4A)。實驗期間處理組的線蟲繁殖能力、咽泵頻率和身體彎曲次數(shù)與對照組無顯著差異，這表明，AABP-1a處理組保持正常的健康狀態(tài)，AABP-1a具有安全性及潛在的抗衰老作用。
抗氧化劑和氧化應(yīng)激途徑可能導致線蟲壽命縮短，熱應(yīng)激還可能導致線蟲的壽命縮短。隨后，研究人員在熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激條件下，評估了AABP-1a對線蟲存活率的影響。實驗表明，AABP-1a在熱應(yīng)激條件下對線蟲存活率無顯著影響，但在氧化應(yīng)激條件下，則可以顯著延長線蟲的壽命。
脂褐質(zhì)，是細胞氧化的產(chǎn)物，也是衰老的關(guān)鍵標志物，其積累水平在秀麗隱桿線蟲中可以被檢測到。實驗結(jié)果表明，低、中、高濃度的AABP-1a處理組均顯著降低線蟲體內(nèi)的脂褐素水平（p < 0.05）。
圖4
6. AABP-1a對p53/p21、p16信號通路的影響
由于AABP-1a能夠通過促進細胞周期停滯來表現(xiàn)其抗衰老效果，研究人員進一步探究了AABP-1a如何影響細胞周期。p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，當細胞遭受DNA損傷或其他壓力時會被激活，激活的p53可以通過多種途徑來調(diào)節(jié)細胞周期，p53可以直接促進p21的表達。p21則是一種細胞周期抑制蛋白，能抑制細胞周期蛋白激酶CDK的活性，阻止細胞進入S期及G2/M期，從而導致細胞周期停滯，并抑制細胞增殖。p16，也稱為CDKN2A，是另一種重要的細胞周期抑制蛋白，通過抑制CDK4和CDK6的活性來阻止細胞進入S期和G2/M期。p16通常在細胞衰老和腫瘤抑制中發(fā)揮作用，其異常表達與多種細胞中異常生長的發(fā)生和進展密切相關(guān)。
細胞及斑馬魚衰老模型的實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組p53/p21和p16的mRNA表達水平顯著升高(p<0.001)，而采用高、中、低濃度的AABP-1a進行處理后，與模型組相比，p53/p21和p16的mRNA表達水平則顯著降低(p<0.001)。因此，可以初步推斷AABP-1a可能通過p53/p21及p16信號通路影響細胞周期，從而發(fā)揮抗衰老作用。
圖5
04、編者點評
本研究首次從知母中分離出具有顯著抗衰老活性的葡甘聚糖AABP-1a，并詳細表征了其結(jié)構(gòu)。AABP-1a 在細胞、線蟲和斑馬魚多種模型中均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗衰老效果，如延長壽命、減輕氧化損傷、改善細胞周期停滯、抑制衰老相關(guān)分泌表型和降低衰老標志物水平等，其作用機制涉及抗氧化、調(diào)控p53/p21和p16信號通路等多方面。該研究不僅豐富了天然多糖抗衰老的理論基礎(chǔ)，也為開發(fā)基于知母多糖的新型抗衰老產(chǎn)品提供了重要依據(jù)，未來的研究將聚焦于深入闡明其作用靶點及構(gòu)效關(guān)系。
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術(shù)服務(wù)體系，開展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實驗室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養(yǎng)平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！