骨髓細(xì)胞染色體制備???
?骨髓染色體標(biāo)本制備通常用于白血病患者，特別是慢性或急性粒細(xì)胞性白血病，因?yàn)楣撬璺从沉Ｏ到y(tǒng)細(xì)胞增生情況，這些病人不宜用外周血。即使是淋巴細(xì)胞性白血病，也不主張用外周血，因?yàn)榧覲HA刺激外周血培養(yǎng)，只能獲得正常淋巴細(xì)胞分裂相，并不能反映那些病理淋巴細(xì)胞的染色體改變。骨髓細(xì)胞屬不斷增殖的細(xì)胞，培養(yǎng)可分短期培養(yǎng)和直接制片法，無論哪種其培養(yǎng)液中均不需加PHA。
一、直接法
（一）試劑準(zhǔn)備
1．PH7.4的PBS或0.9%的生理鹽水20ml。
2．0.2%肝素。
3．0.0005%秋水仙酰胺溶液。
4．0.075mol/L KCL溶液
5．3:1甲醇、冰醋酸溶液。
6．10%Giemsa染色液。
（二）操作程序
1．標(biāo)本采集。用肝素濕潤的針筒抽取骨髓2ml或更多，立即注入含1640培養(yǎng)基的標(biāo)本瓶中。
2．細(xì)胞接種。將標(biāo)本瓶帶回實(shí)驗(yàn)室后，先做骨髓有核細(xì)胞計數(shù)，再按8×106/ml的細(xì)胞密度注入標(biāo)本瓶中，然后補(bǔ)充PH為7.4的PBS或0.9%NS至20ml。
3．阻留中期分裂相。立即加入秋水仙酰胺，終濃度為0.05μg/ml，搖勻后置37℃溫箱中1h。
4．收獲細(xì)胞。將培養(yǎng)物吸至尖底離心管，離心，1000轉(zhuǎn)/min，10min。
5．低滲。棄上清液，沿管壁緩緩加入預(yù)溫37℃的0.075mol/L KCL溶液6～8ml，吹打混勻后置37℃溫箱30min。
6．預(yù)固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混勻。
7．離心。1000轉(zhuǎn)/min,10min。
8．固定。吸去上清液，加新鮮配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6～8ml，吹打混勻。
9.離心。1000轉(zhuǎn)/min，10min。
10．重復(fù)9、10步驟兩遍，使細(xì)胞經(jīng)過3次固定，除第一次固定至少30min外，其余兩次固定，每次15min或30min均可。
11．細(xì)胞懸液的制備和保存。吸去上清液，加入適量固定液，制成濃度合適的細(xì)胞懸液。此液置-20℃冰箱中可保存1至數(shù)年。在此期間可隨時取出，供各種顯帶處理或FISH檢測之用。
12．制片。用吸管將細(xì)胞懸液輕輕打勻后吸取少量，從10cm高處滴至一端傾斜15o的經(jīng)冰水或20%乙醇浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每片滴2～3滴，然后在酒精燈上焰上來回通過數(shù)次，使其干燥。
13．染色。標(biāo)本采用10% Giemsa染色液染色20～30min，流水沖洗，待干，鏡檢。剩余標(biāo)本置4℃冰箱或-20℃冰箱備做各種顯帶之用。
（三）注意事項(xiàng)
1．骨髓直接法應(yīng)在標(biāo)本采集后1h內(nèi)進(jìn)行，超過此時間則細(xì)胞活力下降而致分裂相少見。
2．骨髓直接法的效果好壞與細(xì)胞接種關(guān)系不大，因此若不準(zhǔn)備進(jìn)行培養(yǎng)者，骨髓抽吸后可立即注入20ml生理鹽水中，而不需要作骨髓有核細(xì)胞計數(shù)。
3．骨髓細(xì)胞染色體制備和外周血染色體制備最主要的不同在于：①秋水仙酰胺終濃度和處理時間：前者0.05μg/ml×1h，后者0.1μg/ml×2～4h；②低滲時間；前者30min，后者15min。
二、短期培養(yǎng)法
（一）試劑準(zhǔn)備
1．培養(yǎng)基的配制和保存。同外周血染色體制備[第二部分第五章一]。
（二）操作程序
1．細(xì)胞接種。將標(biāo)本瓶帶回實(shí)驗(yàn)室后，先做骨髓有核細(xì)胞計數(shù)，再按1～3×106/ml的細(xì)胞密度注入標(biāo)本瓶中，然后補(bǔ)充PH為7.4的PBS或0.9%NS至20ml。
2．細(xì)胞培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶放入37℃溫箱中持續(xù)培養(yǎng)24或48h，其間定時搖勻培養(yǎng)物。
3．阻留中期分裂相。于終止培養(yǎng)前2-4h加入秋水仙酰胺，終濃度為0.1μg/ml。
4．收獲細(xì)胞。將培養(yǎng)物吸至尖底離心管，離心，1000轉(zhuǎn)/min，10min。
5．低滲。吸去上清液，加入預(yù)溫至37℃的0.075mol/L KCL溶液6～8ml，用吸管吹打混勻后置37℃溫箱15min。
6．預(yù)固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混勻。
7．離心。1000轉(zhuǎn)/min,10min。
8．固定。吸去上清液，加新鮮配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6～8ml，吹打混勻。
9.離心。1000轉(zhuǎn)/min，10min。
10．重復(fù)9、10步驟兩遍，使細(xì)胞經(jīng)過3次固定，除第一次固定至少30min外，其余兩次固定，每次15min或30min均可。
11．細(xì)胞懸液的制備和保存。吸去上清液，加入適量固定液，制成濃度合適的細(xì)胞懸液。此液置-20℃冰箱中可保存1至數(shù)年。在此期間可隨時取出，供各種顯帶處理或FISH檢測之用。
12．制片。用吸管將細(xì)胞懸液輕輕打勻后吸取少量，從10cm高處滴至一端傾斜15o的經(jīng)冰水或20%乙醇浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每片滴2～3滴，然后在酒精燈上焰上來回通過數(shù)次，使其干燥。
13．染色。標(biāo)本采用10% Giemsa染色液染色20～30min，流水沖洗，待干，鏡檢。剩余標(biāo)本置4℃冰箱或-20℃冰箱備做各種顯帶之用。
（三）注意事項(xiàng)
1．細(xì)胞密度以1～2×106/ml左右為宜。
2．遠(yuǎn)距離運(yùn)送的標(biāo)本必須在24h內(nèi)投入培養(yǎng)。
3． 改良方法有以下兩種，可任擇其一：①收獲細(xì)胞前6h加入10-5mol/L的胸腺嘧啶核苷（Tdr），秋水仙酰胺處理時間縮短為10～30min；②收獲細(xì)胞前2h加入終濃度為10μg/ml的溴乙錠，秋水仙酰胺處理時間不變。