2022年11月，四川大學華西醫院神經外科團隊在Clinical Immunology上發表文章。實驗使用轉錄組和多色免疫熒光樣本分析技術檢測ICs的特征。我們發現B7-H3隨著年齡和級別的上升而增加，并在轉錄和蛋白質組水平預測較差的總生存(OS)。
VISTA和PD-L1在RNA水平上與OS和分級相關。在蛋白質水平上，VISTA主要在腫瘤細胞和腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）中表達。B7-H3、VISTA與PD-L1呈正相關。PD-L1與CD3、Vista與IBA-1有很強的相關性。在T細胞中，我們發現ICs有很強的相關性，而TAMs和腫瘤細胞的相關性更差。總之，B7-H3是免疫治療的重要預后指標。為腦膠質瘤的免疫抑制微環境提供了一個潛在的機制。
B7-H3是文中進行協同研究的另一個腫瘤免疫治療的靶標，其表達水平也影響著腫瘤的遷移和侵襲。本文作者表示，B7 - H3在細胞的胞漿和胞膜均有表達，在蛋白水平上，其表達情況與膠質瘤的級別增加有關，并預示著更差的總體生存率，先前的研究結果和轉錄組水平數據也證明了這點。
V-domain Ig suppressor of T cell activation（VISTA） ，亦稱PD-1H、B7-H5，與CTLA-4、PD-1/PD-L1一樣屬于B7家族分子，是近來研究較為火熱的抑制性免疫檢查點。CTLA-4表達于T細胞活化后不久，在T細胞致敏階段限制協同刺激/抑制T細胞活化；PD-1表達于T細胞致敏后，在效應階段抑制T細胞；VISTA很特別：以組成型表達于na?ve T cell，能獨立抑制T細胞活化以維持T細胞靜息狀態，相對在T細胞免疫作用中處于上游控制階段，其重要性不言而喻。
實驗部分/EXPERIMENTAL SECTION
腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）的計劃以及空間分布，與腫瘤患者的預后生存密切相關，已經被發現其可以作為免疫微環境中的重要靶點，調節腫瘤相關的免疫反應。
01
在之前轉錄組水平的研究數據中發現，IBA-1+TAMs與VISTA具有相關性，但是缺乏單細胞蛋白水平的研究佐證。本文中，研究者使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光譜組織掃描定量分析系統獲取圖像。獲取到圖像利用StrataQuest軟件進行定量分析。首次在蛋白水平發現VISTA與IBA-1+的TAMs在膠質細胞瘤中存在單細胞共表達情況，在TAMs和腫瘤細胞中，VISTA可能發揮著更為重要的作用，這個發現為今后作用于免疫治療靶點的調控機制帶來了新的探索思路。
02
在TAMs研究過程中，TissueGnostics公司根據用戶需求，推出了《腫瘤相關巨噬細胞研究白皮書》，書中闡述了TAMs研究的意義，以及最重要的常見TAMs多重染色Panel，包括其染色方法、推薦抗體、使用TG技術發表的高分文獻——相比傳統的IF免疫熒光，TissueFAXS Cytometry可以在一張樣本上進行10種特異性蛋白標記，并對單水平的細胞蛋白表達量進行精準量化分析。
03
TissueFAXS Cytometry技術在單細胞水平的研究中，針對單個細胞可以分別定量其蛋白在細胞質、細胞膜中的表達強度，為研究者對單細胞組學中蛋白表達空間驗證的細化研究提供了幫助。
實驗步驟/EXPERIMENTAL PROCEDURES
利用光譜庫進行光譜拆分，獲得單通道熒光信號。DAPI通道識別單細胞。以細胞核為中心，根據每個蛋白的染**況設定距離半徑，得到每個蛋白的熒光染色信號。然后，根據每個通道的染**況設定閾值，劃分陽性細胞群，計數陽性細胞。同時還計算了雙陽性細胞的數量和強度。平均染色強度乘以陽性細胞數量，并將它們除以總細胞數得到基因表達平均值。
實驗數據/EXPERIMENTAL DATA
Fig 1：多重免疫熒光定量膠質瘤中VistA、B7H3、PDL1、CD3、IBA-1和GFAP的表達水平。顯示不同級別膠質瘤的Vista、B7H3、PDL1、CD3、IBA-1和GFAP的多重免疫熒光圖像。
Fig 2 ：PD-L1、B7-H3、Vista與CD3、IBA-1、GFAP在腦膠質瘤中的位置關系。
(A)PD-L1與蛋白在腦膠質瘤中的表達、定位和共定位。(B)VISTA與蛋白在腦膠質瘤中的表達、定位及共定位。(C)B7-H3與蛋白在腦膠質瘤中的表達定位和共定位。(D)B7H3、VISTA和PD-L1的表達情況。
Fig 3 ：不同基因在腦膠質瘤中的表達水平。
Fig 4 ：PD-L1、B7-H3、Vista與蛋白的共定位關系。
(A) PD-L1與B7-H3呈正相關。(2)Vista與PD-L1呈正相關。(3)VISTA與B7-H3呈正相關。(D)IBA-1與CD3呈正相關。(F)GFAP與Iba-1的相關性(R2=0.00044，p=0.79)(G)CD3與PD-L1呈顯著正相關 (H) Iba-1與PDL1呈正相關 (J)B7-H3與CD3呈正相關 (K)B7-H3與IbA-1呈正相關(L)B7-H3與GFAP呈負相關(M)VISTA與CD3呈正相關(N)B7-VistA與IBA-1呈正相關。