肌腱病是一種進(jìn)行性肌肉骨骼疾病，其特征是肌腱的炎癥和退行性變化，導(dǎo)致疼痛、腫脹和功能受損，然而目前仍缺乏有效的治療方法。在肌腱病和其他疾病的起始和進(jìn)展過(guò)程中，各種亞型的免疫細(xì)胞在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而在這些免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞能夠浸潤(rùn)受損的肌腱，調(diào)節(jié)局部炎癥及愈合過(guò)程。巨噬細(xì)胞的表型包括M1和M2表型，其中M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)至損傷部位，釋放各種不利于組織修復(fù)的促炎細(xì)胞因子，而M2巨噬細(xì)胞能夠參與后期的愈合過(guò)程，具有清除細(xì)胞內(nèi)病原體和促進(jìn)肌腱再生的能力。基于此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性可能是治療肌腱病變的一種有效治療途徑。
近年來(lái)，干細(xì)胞源性的小細(xì)胞外囊泡（sEVs）在各種疾病中的治療作用得到廣泛的關(guān)注。2020年，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院汪泱教授團(tuán)隊(duì)于J Extracell Vesicles發(fā)表的“Human ESC-sEVs alleviate age-related bone loss by rejuvenating senescent bone marrow-derived mesenchymal stem cells”文章中，發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡中含有多種年輕化因子蛋白成分，并能夠促進(jìn)衰老小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞年輕化。此外，目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)了sEVs治療肌腱病變的潛在機(jī)制。值得關(guān)注的是，一些針對(duì)成體干細(xì)胞衍生的大細(xì)胞外囊泡（lEVs）的研究表明，lEVs可能實(shí)現(xiàn)與sEVs類似的治療功能，而干細(xì)胞衍生的lEVs是否能夠有效治療肌腱病變尚不清楚。
2022年8月，汪泱教授團(tuán)隊(duì)在細(xì)胞外囊泡的研究中再次獲得突破，于Bioactive Materials發(fā)表了題為“Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity“文章。文章研究了誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的lEVs (iMSC-lEVs)在肌腱病變中的治療作用以及iMSC-lEVs在體外對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)、RNA測(cè)序、蛋白免疫印跡等技術(shù)方法，研究表明iMSC-lEVs能夠部分通過(guò)DUSP2和DUSP3來(lái)介導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)通路，并使M1巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞進(jìn)行極化轉(zhuǎn)變，從而減輕肌腱病變中的疼痛和炎癥。其中，中科新生命為該研究提供了細(xì)胞外囊泡蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)。
近年來(lái)，干細(xì)胞源性的小細(xì)胞外囊泡（sEVs）在各種疾病中的治療作用得到廣泛的關(guān)注。2020年，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院汪泱教授團(tuán)隊(duì)于J Extracell Vesicles發(fā)表的“Human ESC-sEVs alleviate age-related bone loss by rejuvenating senescent bone marrow-derived mesenchymal stem cells”文章中，發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡中含有多種年輕化因子蛋白成分，并能夠促進(jìn)衰老小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞年輕化。此外，目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)了sEVs治療肌腱病變的潛在機(jī)制。值得關(guān)注的是，一些針對(duì)成體干細(xì)胞衍生的大細(xì)胞外囊泡（lEVs）的研究表明，lEVs可能實(shí)現(xiàn)與sEVs類似的治療功能，而干細(xì)胞衍生的lEVs是否能夠有效治療肌腱病變尚不清楚。
2022年8月，汪泱教授團(tuán)隊(duì)在細(xì)胞外囊泡的研究中再次獲得突破，于Bioactive Materials發(fā)表了題為“Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity“文章。文章研究了誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的lEVs (iMSC-lEVs)在肌腱病變中的治療作用以及iMSC-lEVs在體外對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)、RNA測(cè)序、蛋白免疫印跡等技術(shù)方法，研究表明iMSC-lEVs能夠部分通過(guò)DUSP2和DUSP3來(lái)介導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)通路，并使M1巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞進(jìn)行極化轉(zhuǎn)變，從而減輕肌腱病變中的疼痛和炎癥。其中，中科新生命為該研究提供了細(xì)胞外囊泡蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)。
iMSC-lEVs在活體肌腱病變模型中的治療機(jī)制及巨噬細(xì)胞復(fù)極調(diào)節(jié)機(jī)制示意圖
研究材料
iMSC-lEVs；iMSC-sEVs；小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW 264.7；大鼠肌腱病變模型；肌腱病患者肌腱組織
技術(shù)路線
- iMSC-sEVs和iMSC-lEVs的分離與表征；
- 建立大鼠肌腱病模型，并在體內(nèi)評(píng)估iMSC-lEVs的鎮(zhèn)痛作用；
- 采用RAW 264.7細(xì)胞，研究iMSC-lEVs對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用；
- RNA-seq方法探究iMSC-lEVs調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型改變的機(jī)制；
- 對(duì)iMSC-lEVs進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析以確定其調(diào)控通路的上游蛋白；
- 研究iMSC-lEVs對(duì)肌腱病患者肌腱組織的作用。
研究結(jié)果
- iMSC-sEVs和iMSC-lEVs的分離與表征
研究人員采用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（IPSC）來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(iMSCs)作為sEVs和lEVs的產(chǎn)生源。利用差速離心分離法從iMSCs培養(yǎng)基中分離并收集iMSC-sEVs (100 nm左右)和iMSC-lEVs (200nm以上)，并通過(guò)透射電鏡、Western blot、NTA粒徑分析對(duì)iMSC-sEVs與iMSC-lEVs進(jìn)行表征。
圖1 iMSC-sEVs and iMSC-lEVs的分離與表征圖
2. iMSC-lEVs可減輕肌腱病相關(guān)疼痛并減少體內(nèi)炎癥
研究人員首先建立了大鼠肌腱病模型，并在體內(nèi)評(píng)估iMSC-lEVs的鎮(zhèn)痛作用。每周以100 μL lEVs（109粒/ml）劑量治療肌腱病變大鼠，與此同時(shí)在同一時(shí)間點(diǎn)以100 μL sEVs（1010粒/ml）劑量進(jìn)行比較治療。采用靜態(tài)疼痛相關(guān)行為分析及步態(tài)分析對(duì)大鼠進(jìn)行疼痛評(píng)估，結(jié)果表明，在治療4周后，應(yīng)用lEVs能夠減輕肌腱病變大鼠的疼痛（圖2a）并顯著改善肌腱病變大鼠的動(dòng)態(tài)行走模式（圖2b和c）。值得一提，結(jié)果表明lEVs治療具有與sEVs相似的鎮(zhèn)痛功能。此外，HE染色結(jié)果顯示，在治療4周后lEVs促進(jìn)了肌腱病變中的肌腱修復(fù)（圖2d和e）。
接下來(lái)研究人員研究了lEVs對(duì)巨噬細(xì)胞表型浸潤(rùn)的影響。 IHC染色結(jié)果顯示，在治療2周和4周后，lEVs治療減少M(fèi)1巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，并促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖2d和e），且lEVs組與sEVs組無(wú)顯著差異（M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可加重肌腱病相關(guān)疼痛，而M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可改善肌腱病相關(guān)疼痛）。免疫組化染色顯示，治療2周和4周后，lEVs和sEVs治療均顯著降低促炎因子的表達(dá)（圖3a和b）。這些數(shù)據(jù)表明，lEVs治療在大鼠肌腱病變模型中具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，且與sEVs的能力相似。
接下來(lái)研究人員研究了lEVs對(duì)巨噬細(xì)胞表型浸潤(rùn)的影響。 IHC染色結(jié)果顯示，在治療2周和4周后，lEVs治療減少M(fèi)1巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，并促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖2d和e），且lEVs組與sEVs組無(wú)顯著差異（M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可加重肌腱病相關(guān)疼痛，而M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可改善肌腱病相關(guān)疼痛）。免疫組化染色顯示，治療2周和4周后，lEVs和sEVs治療均顯著降低促炎因子的表達(dá)（圖3a和b）。這些數(shù)據(jù)表明，lEVs治療在大鼠肌腱病變模型中具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，且與sEVs的能力相似。
圖2 iMSC-lEVs治療可改善疼痛相關(guān)行為并調(diào)節(jié)體內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)
圖3 iMSC-lEVs治療降低大鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)
3. iMSC-lEVs在體外調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變
為了進(jìn)一步研究iMSC-lEVs對(duì)巨噬細(xì)胞復(fù)極的調(diào)節(jié)作用，研究人員采用RAW 264.7作為研究對(duì)象。在驗(yàn)證lEVs和sEVs可以被RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)化后，用100 ng/ml LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞6 h，從而誘導(dǎo)為M1型巨噬細(xì)胞，然后分別用sEVs或lEVs處理48 h，而未受LPS刺激和處理的細(xì)胞被認(rèn)為是M0型巨噬細(xì)胞。通過(guò)RT-qPCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lEVs處理降低了促炎基因的表達(dá)，并增加抗炎基因的表達(dá)。進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)分析表明，在lEVs治療后，M1巨噬細(xì)胞的百分比下降，而M2巨噬細(xì)胞的百分比增加。此外，108粒/mL的lEVs與109粒/mL的sEVs具有相似的功能。這些結(jié)果表明iMSC-lEVs能夠調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并抑制炎癥（圖4）。
圖4 iMSC-lEVs在體外以劑量依賴性的方式調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化
4.iMSC-lEVs通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK信號(hào)通路部分調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化
為了研究iMSC-lEVs調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化轉(zhuǎn)變的機(jī)制，研究人員使用RNA-seq分析iMSC-lEVs處理后RAW 264.7細(xì)胞的基因表達(dá)。采用GSEA與IPA分析挖掘數(shù)據(jù)結(jié)果，顯示許多差異表達(dá)基因與炎癥過(guò)程高度相關(guān)，主要包括p38 MAPK信號(hào)通路等。為了驗(yàn)證iMSC-lEVs可能通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK信號(hào)通路使巨噬細(xì)胞從M1極化至M2，研究人員通過(guò)Western blot檢測(cè)不同條件下巨噬細(xì)胞中p38的磷酸化水平。結(jié)果顯示，LPS刺激后p38的磷酸化水平上調(diào)，而lEVs處理后p38的磷酸化水平降低，說(shuō)明lEVs可以抑制p38 MAPK通路的激活。之后研究者在iMSC-lEVs中加入p38 MAPK激動(dòng)劑并與LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞共孵育48h，結(jié)果表明加入p38 MAPK激動(dòng)劑后，M1巨噬細(xì)胞的百分比增加，M2巨噬細(xì)胞的百分比降低，說(shuō)明lEVs的復(fù)極化調(diào)節(jié)功能部分被p38 MAPK信號(hào)通路的激活所阻斷。綜上結(jié)果，表明iMSC-lEVs調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞復(fù)極化至少部分是通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通路。
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圖5 RNA-seq分析LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞在iMSC-lEVs處理后的轉(zhuǎn)錄組變化
5.iMSC-lEVs可向巨噬細(xì)胞傳遞DUSP2和DUSP3
圖6 iMSC-lEVs的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
6、iMSC-lEVs調(diào)節(jié)人肌腱組織中巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性和浸潤(rùn)性炎癥細(xì)胞因子
進(jìn)一步的，研究者探究iMSC-lEVs在肌腱病患者中的效果。選取肌腱病患者的肌腱組織，并與iMSC-lEVs體外培養(yǎng)。結(jié)果顯示，iMSC-lEVs顯著降低M1巨噬細(xì)胞的比例，并增加M2巨噬細(xì)胞的比例。此外，iMSC-lEVs能夠降低炎性細(xì)胞因子IL-1β、tnf - α、IL-6和NGF的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)與之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，從而進(jìn)一步證實(shí)iMSC-lEVs對(duì)人體肌腱組織的有效性。
小結(jié)：
文章作者證明iMSC-lEVs能夠部分通過(guò)DUSP2和DUSP3介導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)通路，使炎性巨噬細(xì)胞向抗炎巨噬細(xì)胞進(jìn)行極化轉(zhuǎn)變，從而減輕肌腱病變中的疼痛和炎癥。這些發(fā)現(xiàn)揭示了iMSC-lEVs在免疫調(diào)節(jié)中的特殊作用，并強(qiáng)調(diào)了一種可改善肌腱病變和其他炎癥疾病的新型有效的無(wú)細(xì)胞療法。
圖5 RNA-seq分析LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞在iMSC-lEVs處理后的轉(zhuǎn)錄組變化
5.iMSC-lEVs可向巨噬細(xì)胞傳遞DUSP2和DUSP3
為了探究iMSC-lEVs調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路的潛在機(jī)制，研究者采用label free對(duì)iMSC-lEVs進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出2208個(gè)蛋白質(zhì)。對(duì)蛋白數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行GO、KEGG以及IPA分析，發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)p38去磷酸化的DUSP2(也稱為PAC1)和DUSP3在iMSC-lEVs中富集。此外Western blot分析表明，iMSC-lEVs培養(yǎng)后M1巨噬細(xì)胞中DUSP2和DUSP3的表達(dá)均升高。這些數(shù)據(jù)表明iMSC-lEVs可以將被包裹的DUSP2和DUSP3傳遞到巨噬細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)p38信號(hào)通路。
圖6 iMSC-lEVs的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
6、iMSC-lEVs調(diào)節(jié)人肌腱組織中巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性和浸潤(rùn)性炎癥細(xì)胞因子
進(jìn)一步的，研究者探究iMSC-lEVs在肌腱病患者中的效果。選取肌腱病患者的肌腱組織，并與iMSC-lEVs體外培養(yǎng)。結(jié)果顯示，iMSC-lEVs顯著降低M1巨噬細(xì)胞的比例，并增加M2巨噬細(xì)胞的比例。此外，iMSC-lEVs能夠降低炎性細(xì)胞因子IL-1β、tnf - α、IL-6和NGF的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)與之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，從而進(jìn)一步證實(shí)iMSC-lEVs對(duì)人體肌腱組織的有效性。
小結(jié)：
文章作者證明iMSC-lEVs能夠部分通過(guò)DUSP2和DUSP3介導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)通路，使炎性巨噬細(xì)胞向抗炎巨噬細(xì)胞進(jìn)行極化轉(zhuǎn)變，從而減輕肌腱病變中的疼痛和炎癥。這些發(fā)現(xiàn)揭示了iMSC-lEVs在免疫調(diào)節(jié)中的特殊作用，并強(qiáng)調(diào)了一種可改善肌腱病變和其他炎癥疾病的新型有效的無(wú)細(xì)胞療法。