編者按
淫羊藿(Epimedii Folium)是中國傳統(tǒng)中藥, 具有很高的藥用價(jià)值，可用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、白癜風(fēng)、腫瘤、生殖及免疫系統(tǒng)疾病等研究與臨床治療。
通過斑馬魚模型，研究人員可以全面、快速地評(píng)估淫羊藿的活性成分、藥效、毒性及代謝過程，為淫羊藿的深入研究和開發(fā)提供了有力的支持。本期我們分享近期發(fā)表的幾篇基于斑馬魚模型開展中藥淫羊藿研究的最新成果~~~
01、利用斑馬魚等揭示治療白癜風(fēng)常用中藥淫羊藿促進(jìn)色素合成作用的分子機(jī)制和藥效物質(zhì)
文章題目
Epimedin B exhibits pigmentation by increasing tyrosinase family proteins expression, activity, and stability
雜志：Journal of Pharmaceutical Analysis（IF=8.8）
發(fā)表時(shí)間：2024年1月
作者：李醫(yī)明、吳華麗團(tuán)隊(duì)
單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院等
文章主題：
近年來，白癜風(fēng)的臨床治療主要集中在抑制自身免疫反應(yīng)和促進(jìn)色素合成兩方面。中藥淫羊藿中的主要活性成分朝霍定B（EB）在免疫調(diào)節(jié)方面已有報(bào)道，而對(duì)黑素細(xì)胞的色素合成過程的影響尚未研究報(bào)道。
因此，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)EB促進(jìn)色素合成的過程進(jìn)行了系統(tǒng)性的體內(nèi)外探討，包括細(xì)胞模型（黑色素瘤細(xì)胞、人原代黑色素細(xì)胞）、人皮膚組織培養(yǎng)模型、模式動(dòng)物斑馬魚色素脫失模型和C57BL/6小鼠色素脫失模型等。首先確定了朝藿定B（EB）是淫羊藿提取物中含量高、活性強(qiáng)、毒性低的主要活性成份，并在細(xì)胞、組織、斑馬魚、小鼠多層面對(duì)EB體內(nèi)外調(diào)控色素方面進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。
采用RNA-Sequencing、激光共聚焦、CO-IP和Proximity Ligation Assay（PLA）鄰位連接等實(shí)驗(yàn)手段闡明EB通過增加酪氨酸酶（TYRs）轉(zhuǎn)錄翻譯和促進(jìn)TYR活性；同時(shí)EB可以逆轉(zhuǎn)TYR和TYRP1（大約60 kDa）的泛素化-蛋白酶體的降解過程，而對(duì)DCT沒有影響，從而達(dá)到增強(qiáng)TYRs蛋白的穩(wěn)定性多種分子機(jī)制來發(fā)揮作用。
該研究首次對(duì)EB在色素合成藥理活性進(jìn)行了探究，并通過體內(nèi)外多種色素脫失模型上評(píng)估EB色素合成作用，發(fā)現(xiàn)EB從表達(dá)、活性和穩(wěn)定性三方面靶向TYRs，從而發(fā)揮色素合成作用，從而初步闡明了臨床治療白癜風(fēng)常用中藥淫羊藿促進(jìn)色素合成作用的分子機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。這一研究成果從分子水平揭示淫羊藿臨床治療白癜風(fēng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為白癜風(fēng)的新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
圖1 EB可靶向TYRs發(fā)揮色素合成作用
02、基于斑馬魚揭示中藥復(fù)方強(qiáng)心飲防治腎上腺素誘導(dǎo)心肌肥厚機(jī)制
文章題目
Qiangxinyin formula protects against isoproterenol- induced cardiac hypertrophy
雜志：Phytomedicine (IF=6.7)
發(fā)表時(shí)間：2024年4月
作者：周忠焱、馬杰、唐靖一、汪玉等
單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院、香港大學(xué)等
文章主題：
心肌肥厚和炎癥、心纖維化同屬于心肌梗死性心力衰竭（HF）的重要特征，心血管疾病是目前老齡化死亡的主要原因，心力衰竭屬于其中最典型的一種高度危及生命的心血管疾病。中藥復(fù)方強(qiáng)心飲（QXY），源自《傷寒論》中所記載的真武湯，由附子、白術(shù)、淫羊藿、豬苓、補(bǔ)骨脂、白芍、川芎、茯苓、鹿角9種中藥組成，已有實(shí)驗(yàn)證明QXY抑制氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞的凋亡，改善慢性心力衰竭患者的心功能狀況。
本研究通過多組學(xué)分析研究，探究中藥復(fù)方強(qiáng)心飲的組方中成分表征和藥效驗(yàn)證。使用UHPLC-MS將QXY的化學(xué)成分量化，運(yùn)用斑馬魚建立異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的心肌肥大模型，驗(yàn)證QXY顯著治療心功能障礙和損傷的作用及作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心飲中含有烏頭原堿（BMA）、白術(shù)內(nèi)酯I（ATL I）、淫羊藿苷（ICA）、槲皮素（QUE）、補(bǔ)骨脂素（PRN）、山奈酚（KMP）、阿魏酸（FA）、原兒茶酸（PCA）等多種活性成分，其中淫羊藿苷（ICA）、補(bǔ)骨脂素（PRN）和阿魏酸(FA)的含量尤為豐富。
在斑馬魚模型上，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心飲顯著緩解ISO引起的心肌損傷指標(biāo)BNP、CKMB、CTNT2升高，并且轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提示其作用機(jī)制與鈣離子信號(hào)有關(guān)。在大鼠心肌細(xì)胞H9c2模型上，強(qiáng)心飲能夠增加SMAD2和MYPT1的磷酸化表達(dá)，抑制MLC的磷酸化表達(dá)，并阻斷鈣內(nèi)流、減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA、刺激ATP的產(chǎn)生、增加線粒體膜電位，從而抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。
圖2 QXY對(duì)ISO誘導(dǎo)的斑馬魚心肌肥大及改善心臟損傷標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平
03、基于斑馬魚評(píng)價(jià)箭葉淫羊藿的代謝-效/毒作用
文章題目
基于斑馬魚M-Act/Tox聯(lián)合評(píng)價(jià)箭葉淫羊藿的代謝-效/毒作用
雜志：中草藥（北大核心期刊，2019年第7期）
發(fā)表時(shí)間：2019年4月
作者：葛靜、凌潔、寧青、劉欣欣、宋捷、韋英杰、賈曉斌
單位：南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院、江蘇省中醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室、中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院
文章主題：
針對(duì)現(xiàn)有體內(nèi)、外模型無法進(jìn)行M-Act/Tox聯(lián)合的在體、高效篩選的技術(shù)瓶頸，本課題組依據(jù)斑馬魚的遺傳發(fā)育與哺乳動(dòng)物高度相似的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)，參考前期相關(guān)研究及國內(nèi)外文獻(xiàn)，提出斑馬魚代謝模型、骨質(zhì)疏松模型及毒性評(píng)價(jià)法有機(jī)整合，可建立M-Act/Tox聯(lián)合的抗骨質(zhì)疏松中藥高效篩選法。對(duì)實(shí)現(xiàn)兼顧有效性與安全性，實(shí)現(xiàn)條件簡(jiǎn)單、高效率、低成本、高靈敏地進(jìn)行中藥在體M-Act/Tox聯(lián)合評(píng)價(jià)具有重要意義。本研究采用提出的斑馬魚M-Act/Tox聯(lián)合法，評(píng)價(jià)箭葉淫羊藿的安全性、抗骨質(zhì)疏松有效性及代謝特性，以期為深入研究其毒/效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。
斑馬魚毒性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，箭葉淫羊藿在500 μg/mL及以上質(zhì)量濃度時(shí)致斑馬魚中毒（臟器變形或死亡），毒性與給藥質(zhì)量濃度和時(shí)間相關(guān)。潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度箭葉淫羊藿（6.25、12.50、25.00 μg/mL）具有明顯的抗?jié)娔崴升堈T導(dǎo)斑馬魚骨丟失作用，而在較高質(zhì)量濃度（100、200 μg/mL）時(shí)抗骨質(zhì)疏松作用則受到抑制，這為安全、有效地使用淫羊藿提供參考。
斑馬魚代謝實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，箭葉淫羊藿中主要多糖基黃酮成分EA、EB、EC和淫羊藿苷經(jīng)斑馬魚作用24 h后，全部脫糖基轉(zhuǎn)化為含有2個(gè)鼠李糖基的SC和1個(gè)鼠李糖基的BI，而SC和BI相對(duì)穩(wěn)定，提示代謝物可能是潛在致毒/致效的關(guān)鍵因素，在前期研究中發(fā)現(xiàn)多糖苷EA、EB和淫羊藿苷對(duì)斑馬魚的毒性小，以淫羊藿苷為代表，發(fā)現(xiàn)其給予斑馬魚后動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化為BI，但未見斑馬魚產(chǎn)生毒性；而EC給予斑馬魚后，動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化為箭藿苷C后毒性增加。本研究亦提示斑馬魚的效應(yīng)/毒性評(píng)價(jià)是基于代謝轉(zhuǎn)化的在體過程。
斑馬魚M-Act/Tox聯(lián)合評(píng)價(jià)法突破了現(xiàn)有體內(nèi)、外模型無法兼顧三者在體與高效評(píng)價(jià)的技術(shù)瓶頸，具有樣品用量小、勞動(dòng)強(qiáng)度小、高效率、低成本、在體化、微板化等優(yōu)點(diǎn)，為高效辯識(shí)壯骨中藥的M-Act/Tox提供思路與方法。
圖3 斑馬魚幼魚(8 dpf)頭骨茜素紅染色顯微成像圖(X100)
04、基于斑馬魚構(gòu)建抗骨質(zhì)疏松的小分子藥物篩選模型
文章題目
Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis
chemical screening
雜志：Animal Models and Experimental Medicine (AMEM)
發(fā)表時(shí)間：2018年4月19日
作者：張晶晶、黃洪新等
單位：廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院等
文章主題：
本研究利用成骨細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(ola.sp7:nlsGFP)，結(jié)合經(jīng)典的糖皮質(zhì)激素地塞米松（dexamethasone，Dex）誘導(dǎo)方法建立了骨質(zhì)疏松斑馬魚模型的研究成果。通過檢測(cè)成骨細(xì)胞綠色熒光蛋白eGFP的信號(hào)面積與強(qiáng)度，來反映骨礦化面積及骨密度情況，并與傳統(tǒng)化學(xué)染色方法進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果證明，利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系構(gòu)建的骨質(zhì)疏松模型來間接反映成骨細(xì)胞密度等的方法便捷、可行、有效，與傳統(tǒng)斑馬魚骨骼化學(xué)染色方法相比，更加穩(wěn)定、省時(shí)、高效，可作為抗骨質(zhì)疏松藥物高通量篩選模型。
利用淫羊藿黃酮等治療誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松斑馬魚后，成骨細(xì)胞密度等得到拯救恢復(fù)。進(jìn)一步基因水平的研究表明，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型主要由于其抑制了成骨細(xì)胞相關(guān)因子osterix, osteocalcin和 osteopontin的表達(dá)，上調(diào)了破骨細(xì)胞相關(guān)基因tartrate-resistant acid phosphatase等的表達(dá)。而淫羊藿黃酮的治療能重新拯救恢復(fù)osterix, osteocalcin和 osteopontin等的表達(dá)水平。
該項(xiàng)研究成果以轉(zhuǎn)基因斑馬魚為工具，結(jié)合經(jīng)典的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型構(gòu)建方法，為抗骨質(zhì)疏松藥物分子的高通量篩選和骨質(zhì)疏松病理機(jī)制的研究提供了便捷、可靠的動(dòng)物研究模型。
圖4 構(gòu)建斑馬魚骨質(zhì)疏松模型
05、淫羊藿及其制劑主要化學(xué)成分與肝損傷作用研究進(jìn)展
文章題目
淫羊藿及其制劑主要化學(xué)成分與肝損傷作用研究進(jìn)展
雜志：中草藥（北大核心期刊，2023年第21期）
發(fā)表時(shí)間：2023年11月
作者：張悅，王佳藝，劉慧敏，殷宏慶，宋麗麗，李遇伯等
單位：天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院等
文章主題：
近年來，有關(guān)淫羊藿及其復(fù)方制劑致肝損傷或引起不良反應(yīng)的報(bào)道逐年增多。本文通過對(duì)淫羊藿及其2種制劑的化學(xué)成分及肝損傷研究進(jìn)行全面歸納總結(jié)，為淫羊藿及其相關(guān)制劑的安全性研究提供參考，同時(shí)為其臨床安全用藥提供思路和支持。
以箭藿苷B為例，目前的研究表明，箭藿苷B可導(dǎo)致斑馬魚胚胎卵黃囊腫脹和吸收延遲，存在發(fā)育毒性，并且在低濃度的條件下仍可引起成年斑馬魚細(xì)胞壞死，中度水腫及輕度空泡改變，但是對(duì)于其毒性作用的機(jī)制還未有研究進(jìn)行詳細(xì)的闡明。
多項(xiàng)研究證明，淫羊藿、壯骨關(guān)節(jié)丸和仙靈骨葆膠囊長(zhǎng)時(shí)間大量給藥后，可引發(fā)肝損傷，其相關(guān)的毒性機(jī)制可能與膽汁酸代謝受阻、肝細(xì)胞凋亡及鐵死亡、細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，氧化應(yīng)激增加等生物學(xué)過程相關(guān)。環(huán)特生物郭勝亞等基于斑馬魚評(píng)價(jià)壯骨關(guān)節(jié)丸的肝臟毒性，結(jié)果表明壯骨關(guān)節(jié)丸導(dǎo)致斑馬魚卵黃囊吸收延遲，誘發(fā)斑馬魚肝臟毒性。時(shí)克等用斑馬魚毒/效同步法評(píng)價(jià)壯骨關(guān)節(jié)丸對(duì)健康魚和骨質(zhì)疏松模型魚的毒性作用，結(jié)果顯示，壯骨關(guān)節(jié)丸對(duì)模型斑馬魚的毒性更強(qiáng)。并且有多項(xiàng)研究表明，淫羊藿中黃酮類成分朝藿定C的代謝產(chǎn)物為箭藿苷C，箭藿苷C的動(dòng)態(tài)增加與淫羊藿毒性產(chǎn)生密切相關(guān)。
除固有毒性成分引發(fā)肝損傷外，以激活NLRP3炎癥小體活性的淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II還可以誘發(fā)特異質(zhì)肝損傷。研究表明，脂多糖可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，在免疫激活的狀態(tài)下，淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II可促進(jìn)NLRP3炎癥小體活化，導(dǎo)致促炎因子的釋放、細(xì)胞焦亡的發(fā)生，從而誘發(fā)特異質(zhì)肝損傷。
為減少肝損傷事件的發(fā)生，使淫羊藿及其制劑更合理、更安全的應(yīng)用于臨床，進(jìn)一步對(duì)以上2種形式的肝損傷進(jìn)行總結(jié)，見圖5。首先需要警惕由長(zhǎng)期、大劑量用藥造成的固有肝毒性。其次，處于免疫應(yīng)激狀態(tài)下的患者，為淫羊藿及其制劑致肝毒性的主要易感人群，此類患者應(yīng)盡量避免使用淫羊藿及其制劑，降低特異質(zhì)肝毒性發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
圖5 淫羊藿及其復(fù)方制劑引起肝損傷推斷圖
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動(dòng)物、人體”四位一體的綜合技術(shù)服務(wù)體系，開展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實(shí)驗(yàn)室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚模型及腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養(yǎng)平臺(tái)，歡迎有需要的讀者垂詢！17364531293（微信同號(hào)）