近日，來自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)與成人重建外科史冬泉團隊在Science Advances上在線發(fā)表了題為Articular fibrocartilage-targeted therapy by microtubule stabilization的工作。該工作首次提出基于纖維軟骨為基礎(chǔ)的透明軟骨修復(fù)策略，并命名為“纖維軟骨透明化”。同時，利用微管穩(wěn)定的機制有效促進纖維軟骨細(xì)胞的纖維化指標(biāo)下降，提高透明軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成，證明了纖維軟骨透明化的可行性和有效性。
研究思路及方法
1.?構(gòu)思纖維軟骨透明化策略
纖維軟骨一直被認(rèn)作為軟骨修復(fù)失敗的標(biāo)志。作者認(rèn)為纖維軟骨作為自我修復(fù)的產(chǎn)物有其自身價值（1、纖維軟骨可直接作為軟骨修復(fù)的 自體生物支架；2、纖維軟骨中含有天然的種子細(xì)胞；3、新生纖維軟骨與宿主軟骨/ 軟骨下骨高度一體化），因此假設(shè)存在一種可以利用纖維軟骨作為原生材料來實現(xiàn)透明軟骨修復(fù)的方法。基于此，提出了一個嶄新的軟骨修復(fù)策略-“纖維軟骨透明化”，實現(xiàn)纖維軟骨透明化策略主要包括兩個角度，其一針對原位的纖維軟骨細(xì)胞進行改造，其二針對原位的纖維軟骨機制進行重塑（圖2）。
2.?探索纖維軟骨形成過程的變化
作者首先在SD大鼠的股骨滑車溝內(nèi)構(gòu)建了軟骨缺損模型，分別在手術(shù)后第2周，第4周，第6周獲取了大鼠膝關(guān)節(jié)樣本。在進行組織學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)大鼠軟骨損傷過程中，在缺損區(qū)域內(nèi)形成的新生軟骨組織均是同時還表達(dá)一型膠原（Col I）和二型膠原（Col II）的纖維軟骨組織。與此同時，在人的纖維軟骨組織內(nèi)，作者還發(fā)現(xiàn)其具有較高表達(dá)的金屬基質(zhì)蛋白酶-13 (MMP13), 說明纖維軟骨同時具有較高的分解代謝水平，會對自身和周圍健康軟骨組織造成進一步影響。進一步分析發(fā)現(xiàn)，作為穩(wěn)定微管的標(biāo)志物，乙酰化的微管蛋白（Ace-tubulin）在纖維軟骨中從損傷早期到晚期的表達(dá)是明顯下降的。同時基于作者前期的研究工作中微管穩(wěn)定可以促進滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化（JW Li et.al. 2021. Front Cell Dev Biol），說明纖維軟骨的形成和微管穩(wěn)定存在一定聯(lián)系。
?3.?纖維軟骨細(xì)胞體外模型的建立
作者通過結(jié)締組織生長因子（CTGF）和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)獲得了誘導(dǎo)性的纖維軟骨細(xì)胞（induced fibrotic chondrocytes，iFCs）。對獲得的iFCs進行mRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)iFCs高表達(dá)纖維化相關(guān)的指標(biāo)，同時與軟骨保護相關(guān)的指標(biāo)有所降低。進一步的蛋白表達(dá)實驗結(jié)果也證實了iFCs的纖維軟骨細(xì)胞表型。
?4.?體外微管穩(wěn)定治療纖維軟骨細(xì)胞
作者使用經(jīng)典微管穩(wěn)定藥物多西他賽（Docetaxel）作用與獲得的iFCs，隨后進行mRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析，結(jié)果表明基因組中纖維化相關(guān)的基因，如Col1a1，F(xiàn)mod以及Col3a1表達(dá)都有所下降，另外與細(xì)胞骨架相關(guān)的基因有所上升。蛋白表達(dá)檢測實驗進一步證實了該結(jié)果。同時，軟骨小球培養(yǎng)實驗和軟骨微團培養(yǎng)試驗也證實了微管穩(wěn)定在纖維軟骨透明化中的潛能。
5.?構(gòu)建纖維軟骨靶向治療體系
基于此，作者根據(jù)纖維軟骨的電荷特性，設(shè)計了一種靶向纖維軟骨的藥物緩釋體系，用于體內(nèi)的纖維軟骨透明化治療。合成后的生物支架能夠在29℃左右交聯(lián)成膠，因此在低溫情況下能有效完成膝關(guān)節(jié)腔的注射操作，利于治療的進行。同時因為生物支架中的顆粒攜帶負(fù)電荷，因此能夠在注射后有效的粘附與纖維軟骨表面，進行藥物緩釋。
作者將構(gòu)建好的纖維軟骨靶向治療生物支架在大鼠軟骨缺損模型建立后的第四周進行膝關(guān)節(jié)腔注射治療。免疫熒光實驗結(jié)果顯示治療組損傷區(qū)域的Ace-tubulin表達(dá)明顯升高，說明微管穩(wěn)定得到有效提升。通過MicroCT以及進一步的組織學(xué)分析，結(jié)果表明在大鼠軟骨缺損模型構(gòu)建后的中晚期（纖維軟骨形成后），可以觀察到在損傷區(qū)形成的纖維軟骨重新展現(xiàn)出了透明軟骨的表型，從而基本驗證了通過微管穩(wěn)定實現(xiàn)纖維軟骨透明化的可行性。
7.?微管穩(wěn)定促進人退表軟骨的透明化表型
作者獲取全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后人膝關(guān)節(jié)軟骨樣本，將其分為對照組和微管穩(wěn)定組進行外植體培養(yǎng)試驗。在外植體培養(yǎng)中，多西他賽孵育能夠明顯提高軟骨細(xì)胞的Ace-tubulin的表達(dá)水平。進一步的蛋白表達(dá)試驗和組織學(xué)分析均表明，微管穩(wěn)定能夠有效將退變纖維軟骨往透明軟骨的方向轉(zhuǎn)變。
8.?微管穩(wěn)定促進纖維軟骨透明化的機制探索
作者通過對兩次mRNA轉(zhuǎn)錄組測序分析的結(jié)果進一步分析，發(fā)現(xiàn)Sparc基因在纖維化時升高，微管穩(wěn)定時降低，結(jié)合蛋白互作分析（PPI）進一步說明該基因為纖維軟骨形成以及微管穩(wěn)定促進纖維軟骨透明化的機制密切相關(guān)。通過動物實驗體內(nèi)的驗證以及小干擾RNA實驗對Sparc蛋白的敲減進一步明確了Sparc在纖維軟骨透明化機制中的重要作用。
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研究總結(jié)
該研究首次將纖維軟骨作為原材料進行軟骨修復(fù)治療，提出“纖維軟骨透明化”的全新治療策略，突破了原有軟骨修復(fù)研究的傳統(tǒng)壁壘。并且使用針對纖維軟骨細(xì)胞微管穩(wěn)定的方法驗證了纖維軟骨透明化的可行性。該研究證實了原位纖維軟骨透明化策略在軟骨修復(fù)中的應(yīng)用效果和治療前景，有望成為骨關(guān)節(jié)炎和軟骨損傷相關(guān)疾病新的治療策略和研究方向，也為軟骨病理生理機制研究提供新的理論基礎(chǔ)。
吉凱助力
本文RNA sequencing and analysis由吉凱基因提供，助力高水平科學(xué)研究。
作者簡介
南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院史冬泉教授為該論文的通訊作者，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院李嘉威博士為該論文的第一作者。
?右：史冬泉教授（通訊作者）
?左：李嘉威博士（第一作者）