冷凍保存細(xì)胞并創(chuàng)建自己的生物樣本庫(kù)是每個(gè)研究人員都需要經(jīng)歷的問題，無(wú)論是細(xì)胞株還是原代細(xì)胞，抑或是用于再生醫(yī)學(xué)的間充質(zhì)干細(xì)胞，冷凍保存可確保再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的高質(zhì)量細(xì)胞隨時(shí)可用。它允許標(biāo)準(zhǔn)化并減少對(duì)新鮮細(xì)胞分離的依賴。
冷凍細(xì)胞后我們總會(huì)在復(fù)蘇的時(shí)候遇到各種各樣的問題：
1. 細(xì)胞活力降低： 在冷凍過程中，細(xì)胞中的水會(huì)形成冰晶，冰晶會(huì)刺穿細(xì)胞膜并破壞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。冷凍過程中水分的去除會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度發(fā)生變化，從而產(chǎn)生滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞收縮并破壞細(xì)胞成分。
2. 冷凍保護(hù)劑的毒性： 二甲基亞砜 (DMSO)、甘油 (GLY)、乙二醇 (EG) 或丙二醇 (PG) 等冷凍保護(hù)劑 (CPA) 是必不可少的，因?yàn)樗鼈冇兄跍p少冰晶形成并保護(hù)細(xì)胞膜。雖然 CPA 是必不可少的，但它們?cè)诟邼舛认驴赡軙?huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。找到冷凍保護(hù)和細(xì)胞毒性之間的最佳平衡至關(guān)重要。
3. 細(xì)胞特性喪失：比如在凍存間充質(zhì)干細(xì)胞的時(shí)候， ECM 為 MSC 保持其干細(xì)胞特性和分化潛能提供了重要線索。冷凍保存會(huì)破壞這些相互作用，從而可能影響間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新和分化為特殊細(xì)胞類型的能力。冷凍和解凍會(huì)改變表觀遺傳景觀間充質(zhì)干細(xì)胞是 DNA 上的化學(xué)修飾，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這些變化會(huì)影響對(duì)干細(xì)胞和分化至關(guān)重要的基因的表達(dá)。
4. 標(biāo)準(zhǔn)化問題： 不同實(shí)驗(yàn)室的冷凍保存方案差異很大，冷凍/解凍速率、冷凍保護(hù)劑濃度和細(xì)胞培養(yǎng)條件各不相同。這種不一致可能導(dǎo)致每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞活力、細(xì)胞特性和整體功能性方面的結(jié)果各不相同。
怎么才能成功的凍存細(xì)胞：
一、準(zhǔn)備階段
將凍存管、離心管、移液管等耗材準(zhǔn)備齊全，放入超凈臺(tái)中，打開紫外線照射30分鐘進(jìn)行消毒。同時(shí)，打開通風(fēng)機(jī)通風(fēng)3分鐘，并用75%酒精擦拭操作臺(tái)和雙手，確保操作環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。此外，還需準(zhǔn)備好冰盒，以及預(yù)熱至37℃的完全培養(yǎng)基、DMSO、胰酶等試劑。
二、細(xì)胞選擇與處理
1.選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、致密度約為80-90%、活力達(dá)90%以上的細(xì)胞進(jìn)行凍存。細(xì)胞活力差的細(xì)胞在凍存后的成活率很小，因此一定要在細(xì)胞旺盛分裂時(shí)期凍存。
2.取出細(xì)胞，進(jìn)行酒精消毒后放入超凈臺(tái)。按照細(xì)胞傳代步驟，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、解離。消化好的細(xì)胞離心后，棄掉上清液。
三、配置凍存液與重懸細(xì)胞
1.配置細(xì)胞凍存液，常用比例為無(wú)血清培養(yǎng)基：血清：DMSO=7：2：1，或含20%血清培養(yǎng)基、10%DMSO。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色，可以用0.22微米濾膜過濾，或直接購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品。凍存液應(yīng)提前配制，防止臨時(shí)配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞。
2.用凍存液重懸細(xì)胞，用移液器輕柔吹打細(xì)胞，避免損傷細(xì)胞。同時(shí)，混勻DMSO要快，因?yàn)镈MSO對(duì)細(xì)胞有毒性，混合后應(yīng)盡快凍存。
四、細(xì)胞計(jì)數(shù)與分裝
1.可用細(xì)胞計(jì)數(shù)板或計(jì)數(shù)儀器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞總數(shù)調(diào)節(jié)至適宜范圍，如1×10^6個(gè)/ml。
2.將細(xì)胞凍存懸液分裝入細(xì)胞凍存管中，一般2ml凍存管裝入1-1.5ml細(xì)胞凍存懸液為宜。然后密封凍存管，并標(biāo)記好細(xì)胞名稱、日期、細(xì)胞狀態(tài)以及凍存者姓名等信息。
五、細(xì)胞凍存
1.按照-4℃30分鐘、-20℃30分鐘、-80℃過夜、液氮保存的順序進(jìn)行凍存。
2.細(xì)胞凍存是慢凍的過程，目的是使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶從而降低對(duì)細(xì)胞的傷害。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，每分鐘降1-3℃是標(biāo)準(zhǔn)的降溫方法。
凍存細(xì)胞需要注意的問題：
1.DMSO本身就有滅菌的作用，因此使用前不需要進(jìn)行高壓滅菌。高壓滅菌反而會(huì)破壞它的分子結(jié)構(gòu)，降低冷凍保存效果。
2.在常溫下，DMSO對(duì)人體有害，應(yīng)注意生物安全防護(hù)。
3.凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復(fù)蘇時(shí)水會(huì)滲入造成污染。
4.細(xì)胞不可長(zhǎng)期保存在-80℃冰箱中，建議在-80℃冰箱中的保存時(shí)間不要超過48小時(shí)，然后盡快轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期保存。
在這里介紹下我們的免程序降溫凍存液，公司有以下兩款自研的配方：
一、低血清免程序降溫凍存液
1. 免程序凍存，細(xì)胞凍存后直接放-80°保存即可，若細(xì)胞長(zhǎng)期不用建議液氮保存
2. 低血清+蛋白組分，滿足細(xì)胞在休眠時(shí)的營(yíng)養(yǎng)需求，適合珍稀細(xì)胞和原代細(xì)胞及細(xì)胞保種
3. 平衡冷凍劑組分，減少細(xì)胞毒性
二、無(wú)血清/無(wú)蛋白組分免程序降溫凍存液
1. 免程序降溫，凍存后直接放-80°即可，若細(xì)胞長(zhǎng)期不用建議液氮保存
2. 凍存液組分明確，不含動(dòng)物源組分不含生長(zhǎng)因子
3. 仿血液內(nèi)氨基酸營(yíng)養(yǎng)組分，滿足細(xì)胞休眠的營(yíng)養(yǎng)所需
4. 平衡的冷凍保存劑組分，減少細(xì)胞毒性；
5. 適用于血液細(xì)胞、無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞及其他腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)期保存
怎么確定復(fù)蘇的細(xì)胞沒有問題：
1 復(fù)蘇的細(xì)胞存活率高，在85%以上。這意味著大部分細(xì)胞在復(fù)蘇過程中保持了活力，是細(xì)胞復(fù)蘇成功的一個(gè)重要指標(biāo)。
2 觀察復(fù)蘇后的細(xì)胞形態(tài)，確保它們與正常生長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)一致，沒有出現(xiàn)異常形態(tài)或細(xì)胞碎片。
3 檢查復(fù)蘇后的細(xì)胞生長(zhǎng)速度，如果它們能夠在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下正常增殖，說(shuō)明復(fù)蘇的細(xì)胞具有正常的生長(zhǎng)能力。
4 進(jìn)行必要的細(xì)胞功能檢測(cè)，如酶活性測(cè)定、蛋白質(zhì)表達(dá)分析等，以進(jìn)一步確認(rèn)復(fù)蘇的細(xì)胞功能正常。
5 定期對(duì)復(fù)蘇后的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察其長(zhǎng)期生長(zhǎng)情況和穩(wěn)定性，確保復(fù)蘇的細(xì)胞能夠持續(xù)保持正常狀態(tài)。