針對(duì)骨骼系統(tǒng)的AAV靶向策略上期已經(jīng)介紹了的血清型以及注射方式，這一期我們將繼續(xù)看看AAV在骨骼系統(tǒng)中的遞送。我們將結(jié)合一篇用到了吉?jiǎng)P產(chǎn)品的文獻(xiàn)[1]，看看在文章中，采用什么樣的AAV遞送方案對(duì)骨骼系統(tǒng)中進(jìn)行研究。
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Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis
Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-1（Runx1）是軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞譜系結(jié)合所必需的，通過(guò)增強(qiáng)脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中的軟骨和成骨的生成。然而，Runx1在關(guān)節(jié)疾病中的潛在作用尚不清楚。在本研究中，旨在探討Runx1在前交叉韌帶置換術(shù)（ACLT）誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎（OA）中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞特異性Runx1基因敲除（Runx1f/fCol2a1-Cre）通過(guò)加速早期骨關(guān)節(jié)炎中蛋白多糖和II型膠原的損失而加劇軟骨破壞。此外，文獻(xiàn)還觀察到，在晚期骨關(guān)節(jié)炎中，生長(zhǎng)板變薄和骨化，軟骨細(xì)胞增殖能力下降，生長(zhǎng)板周圍骨基質(zhì)丟失。并且通過(guò)腺相關(guān)病毒（AAV）在關(guān)節(jié)軟骨中過(guò)表達(dá)Runx1，并通過(guò)減緩早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨中骨關(guān)節(jié)炎的破壞和減輕炎癥反應(yīng)來(lái)確定其保護(hù)作用。
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結(jié)果1：Runx1基因敲除加重骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞
研究人員首先通過(guò)將Runx1f/f和Col2a1-CreERT雜交，得到Runx1f/+Col2a1-CreERT小鼠。為了探究Runx1在軟骨骨關(guān)節(jié)炎（OA）的病理過(guò)程，研究人員通過(guò)腹腔注射他莫昔芬在軟骨中實(shí)現(xiàn)了Runx1的敲除。收集膝關(guān)節(jié)的組織發(fā)現(xiàn)，Runx1在關(guān)節(jié)軟骨和生長(zhǎng)板中的表達(dá)都顯著減少。并且進(jìn)行體內(nèi)成像發(fā)現(xiàn)，在Runx1CKO組中，觀察到關(guān)節(jié)變形以及組織碎片。通過(guò)HE染色以及Masson染色發(fā)現(xiàn)，Runx1 CKO組比WT組關(guān)節(jié)破壞更加嚴(yán)重，并且軟骨標(biāo)志物膠原II（Col2a1）和SOX9的表達(dá)量低于WT組。這些結(jié)果都表明，Runx1基因敲除加速了全膝關(guān)節(jié)與關(guān)節(jié)軟骨的破壞。
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結(jié)果2：Runx1基因敲除對(duì)骨關(guān)節(jié)炎晚期生長(zhǎng)板軟骨病理變化的影響
為了進(jìn)一步研究Runx1在晚期中的效果，研究人員接下來(lái)分析了在前交叉韌帶置換術(shù)（ACLT）手術(shù)24周的股骨的生長(zhǎng)板軟骨的病理變化。組織學(xué)結(jié)果表明在生長(zhǎng)板軟骨以及軟骨細(xì)胞中增加的骨化基質(zhì)傾向于直接暴露在髓腔中(圖2a)。μ-CT分析顯示生長(zhǎng)板軟骨厚度顯著減少（圖2b）。相比較WT，敲除組的骨化區(qū)明顯丟失（圖2c）。定量的生長(zhǎng)板厚度的分析（圖2d）和BV/TV（圖2e）證實(shí)了這些結(jié)果。IHC染色用于用PCNA檢測(cè)軟骨細(xì)胞的增殖能力（圖2f），顯示Runx1敲除OA組中數(shù)量增加的軟骨細(xì)胞失去了其增殖能力。然后，研究人員通過(guò)IHC測(cè)量Col2a1的表達(dá)（圖2g）和通過(guò)IF測(cè)量SOX9（圖2h），結(jié)果表明與野生型OA組相比，Runx1敲除OA組中Col2a1和SOX9的表達(dá)減少。這些結(jié)果表明，Runx1基因敲除影響OA晚期生長(zhǎng)板軟骨的病理進(jìn)展。
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結(jié)果三：Runx1過(guò)表達(dá)減緩骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞
接下來(lái)，研究人員在體內(nèi)利用AAV建立了Runx1過(guò)表達(dá)模型：在ACLT手術(shù)恢復(fù)3-5天之后，將AAV-Runx1注射到關(guān)節(jié)腔內(nèi)，通過(guò)體內(nèi)成像（圖3a）顯示，AAV-Runx1過(guò)表達(dá)對(duì)軟骨的破壞有保護(hù)作用。根據(jù)HE染色以及Masson染色（圖3b）表明，相比較WT組，AAV-Runx1保留了關(guān)節(jié)軟骨的完整性。接著研究人員檢測(cè)了AAV-Runx1對(duì)COL2A1和SOX9表達(dá)的影響，結(jié)果表明相比較WT組AAV-Runx1組表達(dá)量相對(duì)較低(圖3d)，SOX9與它的趨勢(shì)相同（圖3e）。這些結(jié)果都表明，AAV-Runx1過(guò)表達(dá)減輕了OA的進(jìn)展并且保護(hù)了膝關(guān)節(jié)的完整性。
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結(jié)果四：Runx1過(guò)表達(dá)減輕骨關(guān)節(jié)炎晚期生長(zhǎng)板軟骨的病理進(jìn)展
接下來(lái)研究人員檢測(cè)了Runx1過(guò)表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎癥晚期生長(zhǎng)板病理進(jìn)展的影響。通過(guò)HE、Masson染色表明，AAV-Runx1過(guò)表達(dá)保留了生長(zhǎng)板軟骨的厚度（圖4b）,軟骨下部區(qū)域的小梁骨也被保留（圖4c）。盡管AAV-Runx1過(guò)表達(dá)的生長(zhǎng)板寬度沒(méi)有達(dá)到WT組的寬度。通過(guò)IHC結(jié)果表明，COL2A1和SOX9的表達(dá)高于WT組（圖4g）。這些結(jié)果證明了，AAV-Runx1在OA病理進(jìn)程中的作用。
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結(jié)果五：ChIP測(cè)序確定軟骨病理學(xué)中的新基因靶點(diǎn)
為了證實(shí)Runx1在軟骨病理中的機(jī)制，研究人員旨在識(shí)別直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子Runx1的潛在的基因靶點(diǎn)。首先，用慢病毒在軟骨細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Runx1，然后用CHIP拉下與此結(jié)合的所有DNA片段，結(jié)果表明16.22%出現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)域（圖5a）。然后通過(guò)KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)富集在Hippo信號(hào)通路。然后研究人員通過(guò)GO分析出這些靶標(biāo)的具體分布比例。分析出了五個(gè)新的靶點(diǎn)被認(rèn)為是和軟骨相關(guān)的。這些靶點(diǎn)是跨膜前后轉(zhuǎn)化1（TAPT1）、蛋白質(zhì)RIC1同源物（RIC1）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20（FGF20），骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B型（BMPR1B）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白5（BMP5）。
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結(jié)果六：在軟骨病理學(xué)，新證實(shí)的和Runx1相互作用的致病因子
對(duì)這五個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，研究人員通過(guò)CHIP-seq獲得基于靶標(biāo)的19個(gè)基序。鑒定了兩個(gè)基序之后找到了與此作用的三個(gè)啟動(dòng)子。為了進(jìn)一步證明這三個(gè)靶標(biāo)的基因表達(dá)，用siRunx1來(lái)檢查基因的變化（圖7a）。結(jié)果表明，TAPT1、RIC1和FGF20的基因表達(dá)水平在siRNA干擾后12小時(shí)降低。接下來(lái)，研究人員用慢病毒表達(dá)Runx1來(lái)檢測(cè)這些靶標(biāo)的變化。IHC（圖7c-h）表明，蛋白質(zhì)水平增加。在ACLT手術(shù)之后12周，結(jié)果表明TAPT1、RIC1和FGF20的基因和對(duì)照組一致。綜上可以看出，這些是Runx1的結(jié)合位點(diǎn)。
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總結(jié)：
在這篇文獻(xiàn)中，作者首先使用Col2a1-Cre 小鼠和SOX9-Cre小鼠雜交，獲得了Runx1敲除的小鼠，證明了Runx1在成年的骨關(guān)節(jié)炎小鼠中的作用。在AAV-Runx1過(guò)表達(dá)模型中，觀察到關(guān)節(jié)破壞、骨關(guān)節(jié)損傷以及生長(zhǎng)板退化。Runx1作為一種多功能的轉(zhuǎn)錄因子，會(huì)涉及包括BMP信號(hào)在內(nèi)的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在這篇文獻(xiàn)中，作者通過(guò)KEGG檢測(cè)了與Runx1相互作用的靶標(biāo)富集分析，發(fā)現(xiàn)這些信號(hào)通路仍在軟骨細(xì)胞中發(fā)揮優(yōu)勢(shì)?？傊@些結(jié)果都表明Runx1可能是一種針對(duì)OA和骨質(zhì)疏松有效的治療靶點(diǎn)。
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吉?jiǎng)P助力：
在這篇文獻(xiàn)中使用了吉?jiǎng)P基因的Runx1的過(guò)表達(dá)AAV。在ACLT手術(shù)之后，AAV-Runx1被注射進(jìn)膝關(guān)節(jié)，滴度為1E11vg/ml,5μl/關(guān)節(jié)。
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參考文獻(xiàn)：
1.????????? Zhou, C., et al., Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis. Bone Research, 2021. 9(1).
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