細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控是衰老再生研究中的重要內(nèi)容。以往研究發(fā)現(xiàn)，異染色質(zhì)相關(guān)蛋白1（Heterochromatin associated protein 1, HP1）作為異染色質(zhì)的特征性蛋白，能夠維持染色體的穩(wěn)定和調(diào)控基因表達(dá)，與細(xì)胞分化具有重要關(guān)系，但是其背后的分子機(jī)制尚不明確。 2021年7月，慕尼黑大學(xué)Heinrich Leonhardt團(tuán)隊在Nucleic Acids Research（IF=16.97）上發(fā)表題為“Phosphorylation of the HP1β hinge region sequesters KAP1 in heterochromatin and promotes the exit from na?ve pluripotency”的文章，該研究利用多組學(xué)技術(shù)（轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、泛素化修飾蛋白組學(xué)）探討HP1調(diào)控細(xì)胞分化的內(nèi)在分子機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)HP1β鉸鏈區(qū)的磷酸化能特異性結(jié)合并招募多能調(diào)控因子KAP1到異染色質(zhì)，促使細(xì)胞原始多能性的退出，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞命運(yùn)決定的新機(jī)制。 【研究材料】 小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)、HEK293T、BHK細(xì)胞 【技術(shù)方法】 轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、泛素化修飾蛋白組學(xué)、ChIP-MS等 步驟1：基因突變與互作蛋白組分析揭示HP1β與細(xì)胞多能態(tài)退出相關(guān) 步驟2：生化實驗發(fā)現(xiàn)CK2a催化HP1β S89磷酸化 步驟3：轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析證實HP1β-pS89促進(jìn)胚胎干細(xì)胞原始多能態(tài)的退出 步驟4：IP-MS發(fā)現(xiàn)HP1β-pS89的互作蛋白KAP1（泛素E3連接酶） 步驟5：泛素化修飾組學(xué)揭示KAP1調(diào)控原始多能態(tài)退出機(jī)制 步驟6：構(gòu)建HP1β與KAP1調(diào)控多能態(tài)退出模型進(jìn)行驗證 1. HP1β缺失阻礙多能態(tài)退出 為了研究HP1β在mESCs分化中的作用，研究人員構(gòu)建了HP1β -/-突變mESCs細(xì)胞，DPAI染色表明HP1β -/-細(xì)胞中染色中心聚集減少，利用ChIP-MS揭示HP1β結(jié)合的蛋白參與到染色質(zhì)區(qū)室化和多能性調(diào)控過程，進(jìn)一步利用神經(jīng)祖細(xì)胞分化試驗闡明HP1β能夠調(diào)控細(xì)胞多能態(tài)退出。 圖1 神經(jīng)細(xì)胞分化需要HP1β的參與 2. CK2催化HP1β絲氨酸89號殘基的磷酸化 為了研究HP1β在多能性退出中的功能，研究人員在2i/LIF（原始態(tài)）和serum/LIF（穩(wěn)態(tài)）培養(yǎng)基中培養(yǎng)mESCs， qPCR結(jié)果顯示在兩種培養(yǎng)條件下HP1β 的表達(dá)量沒有差異，但是Western Blot結(jié)果顯示蛋白表達(dá)具有差異性，提示翻譯后調(diào)控的作用。進(jìn)一步用熱敏磷酸酶分析和突變分析，研究人員發(fā)現(xiàn)在HP1β絲氨酸89位殘基被磷酸化修飾（HP1β-pS89），且該位點是被酪氨酸激酶2（casein kinase 2，CK2a）催化。 在酪氨酸激酶2（casein kinase 2）的結(jié)合域之內(nèi)。進(jìn)一步利用CRISPR-CA9構(gòu)建CK2a類似物敏感突變（CK2a1as），加入嘌呤類似物1-NA-PP1之后，發(fā)現(xiàn)HP1β-pS89降低，表明CK2a催化HP1β絲氨酸89位殘基的磷酸化。 圖2 CK2a催化HP1β絲氨酸89位殘基的磷酸化 3. HP1β-pS89促進(jìn)胚胎干細(xì)胞原始多能態(tài)的退出 研究人員構(gòu)建了磷酸化突變細(xì)胞系HP1β S89A和模擬磷酸化的HP1β S89E、 HP1β S89D突變細(xì)胞系。對突變細(xì)胞系進(jìn)行形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)亞穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)條件下HP1β S89A和HP1β-/-發(fā)現(xiàn)更多的原始態(tài)原型菌落。對不同時期突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明HP1β S89A與HP1β S89E以相反的方式影響基因的表達(dá)，原始態(tài)的多能基因在HP1β S89A和HP1β-/-中明顯上調(diào)。綜上，HP1β pS89是mESCs原始多能態(tài)的退出的必要條件。 圖3 HP1β S89A促進(jìn)mESCs原始多能態(tài)的退出 4. KAP1調(diào)控原始多能性退出機(jī)制研究 為了研究HP1β S89A如何影響mESCs原始多能態(tài)的退出機(jī)制，研究人員在HEK293T細(xì)胞中成功表達(dá)GFP-HP1β S89D, 利用IP-MS鑒定得到互作蛋白KAP1，結(jié)合油滴實驗和KAP1突變體實驗結(jié)果，表明KAP1的CCN結(jié)構(gòu)域能特異性結(jié)合HP1β磷酸化位點。對KAP1-/-進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明下調(diào)的細(xì)胞分化基因與HP1β S89A和HP1β-/-中的情況一致。 前人研究發(fā)現(xiàn)KAP1具有泛素E3連接酶的活性，為了探索KAP1在多能維持中的作用機(jī)制，研究者對野生型和 KAP1-/-細(xì)胞進(jìn)行泛素化修飾蛋白組學(xué)分析，結(jié)果表明KAP1通過對異染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄因子的泛素化來調(diào)節(jié)多能性。 圖4 KAP1依靠其泛素化酶活性來調(diào)節(jié)多能性 5. KAP1調(diào)控多能性退出依賴于HP1β的磷酸化 研究人員利用CHIP-MS在mESCs鑒定原始態(tài)到外胚層分化過程中HP1β的結(jié)合蛋白，結(jié)果顯示在外胚層中，HP1β能夠與KAP1和其他染色質(zhì)調(diào)控因子互相結(jié)合。此外，利用GFP熒光觀察到在多能性退出時KAP1向染色中心聚集，并且在HP1β S89E中更加明顯，這表明KAP1向染色中心的聚集依賴于HP1β-pS89。綜上結(jié)果表明，HP1β S89磷酸化特意招募轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子KAP1，共同調(diào)控原始多能態(tài)的退出。 小結(jié) 本研究整合互作蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和泛素化修飾蛋白組學(xué)探討了異染色質(zhì)捕獲調(diào)控因子的分子機(jī)理。通過組學(xué)分析揭示染色質(zhì)結(jié)合蛋白HP1β參與調(diào)控細(xì)胞染色質(zhì)區(qū)室形成以及細(xì)胞多能態(tài)變化，HP1β磷酸化能在異染色質(zhì)上捕獲轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子KAP1，調(diào)控細(xì)胞分化過程，這種多能性關(guān)鍵調(diào)控因子的捕獲促進(jìn)了多能態(tài)的退出，揭示了一種遠(yuǎn)程控制轉(zhuǎn)錄調(diào)控的新機(jī)制。
實驗路線圖
研究結(jié)果
圖5 HP1β磷酸化捕獲KAP1結(jié)合到異染色質(zhì)上，促進(jìn)mESCs多能性的退出
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Nucleic Acids Res（IF 16.97）| 何去何從？多組學(xué)助力發(fā)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控新機(jī)制
作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-23T19:55 (訪問量:4835)
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