摘要：
提取小鼠肌肉dna所使用的四種均質法進行對比。1.手動液氮研磨（研缽和杵），2.opsd的cryogrinder液氮研磨，3.轉子定子研磨，4.ht homogenizer 高通量組織研磨機。用上述四種方法對dna產率，純度和片段大小的參數進行比較。轉子－定子勻漿器產生的最小的片段，而cryogrinder產生最大的dna片段，ht homogenizer的dna產量最高，而傳統的液態氮冷凍手動研缽研磨dna產量最少。ht homogenizer珠磨式產生最高純度的樣品，轉子-定子提取的dna純度最低。
簡介：
樣品破碎是rna，dna和蛋白質分離的早期必要步驟，分為物理破碎和化學破碎?；瘜W方法通常依賴于去除劑（detergents）和離液劑（chaotropes）；物理法則包括混合研磨機（磁珠攪拌器）、超聲、研缽和杵、及手持式均質器（轉子-定子法）。
雖然化學裂解往往是最有效的方法，但它破壞固體組織并不總是完全可靠。機械破碎的兩種常用方法是通過使用轉子-定子，它涉及剪切或切割，并通過珠磨儀或研缽和杵進行二次粉碎。
轉子-定子用于快速剪切樣品。它實質上是一個圓形的剪刀，非常類似手持式均質器。轉子-定子是均質樣本的典型工具。ht高通量組織研磨機，用于單個樣品或高通量應用。8字形的運行方式已被往復直線運動取代。研缽和杵是用于磨樣的歷史性的工具。它可有效分離樣品dna和rna。cryogrinder?作為代替研缽的最小型研磨器，可用于研磨非常微量的樣品（100毫克左右）。
本文用市售的試劑盒在四種研磨方式中進行比較。
材料和方法
組織樣品：雌性cd1小鼠42天（charles river實驗室），使用和提取的腿部肌肉，冷凍，并貯存于-140℃下。均質化，組織解凍，如下所述進行處理。
組織dna純化：小鼠肌肉（25毫克），使用qiaamp dna mini試劑盒。
小鼠肌肉組織用cryogrinder冷凍均質或研缽與杵液氮處理后轉移到溶液中。
而rotor-stator轉子-定子 和 ht homogenizer 高通量組織研磨機的樣品則直接在緩沖液中勻漿。在這兩種情況下，隨后加入sds和蛋白酶k。
純化的dna在260和280nm處通過分光光度法進行分析，以測量濃度和純度。瓊脂糖凝膠電泳（在1x tae緩沖液的1％瓊脂糖）被用來評估分離的dna的片段大小。dna樣本電泳前用20x酒精沉淀。
均質化方法：用液氮冷卻的研缽和杵（coors）； cryogrinder液氮冷凍研磨器（opsd）；轉子-定子均質器（virtis）；ht homogenizer高通量組織研磨機（opsd）進行。如下：
表1.均質化小鼠肌肉組織的方法
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研缽和杵（手動） |
樣品（25mg），用液氮冷凍，置于低溫冷凍150mm研缽中，用冷卻的研杵手動粉碎。粉碎的肌肉被轉移到一個冷卻的2ml離心管中，并懸浮于裂解溶液中。 |
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cryogrinder? (電動研缽和杵) （opsd） |
樣品（25mg）從制冷機（盛放液氮的裝置）取出后放入預冷cryogrinder缽體，慢慢調試至合適的速度后粉碎樣品，后轉移到一個冷卻的2ml離心管中，并懸浮于裂解溶液中。 |
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ht高通量組織研磨機（opsd） |
樣品（25mg）置于96孔板中，含1個4mm不銹鋼研磨球，加緩沖液，1200轉2min。將裂解物轉移到2ml的離心管中。 |
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rotor-stator （virtis） |
樣品（25mg）加入緩沖液以10k轉速，6mm的直徑，4毫升離心管勻漿2分鐘（virtis）。將裂解物轉移至2 ml離心管中 |
結果
表2.光密度，比率，純化的dna產量
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260 nm |
280 nm |
ratio |
dna yield (μg) |
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ht homogenizer |
1.50 |
0.85 |
1.77 |
30.1 |
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rotor-stator |
0.71 |
0.55 |
1.29 |
14.2 |
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mortar and pestle研缽和杵 |
0.20 |
0.14 |
1.41 |
4.0 |
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cryogrinder |
0.46 |
0.29 |
1.60 |
9.2 |
樣品均質化的方法影響dna產量，純度和片段大小。
dna產量：ht homogenizer高通量組織研磨機提取的dna產量最高，隨后是轉子-定子和cryogrinder，而研缽和杵的dna產率最低。
dna純度：ht homogenizer高通量組織研磨機的260/280比率表明其純度最高，cryogrinder也有較高的純度，其次是研缽和杵，轉子-定子純度最低。
片段大?。?/strong>片段大小受均質化方法的影響顯著，轉子-定子剪切法從約15kb處產生連續片段（圖1），ht homogenizer高通量組織研磨機產生比轉子-定子更窄的大片段范圍，cryogrinder產生了比其他方法更寬范圍的大片段。除了片段大小之外，在對應于ht homogenizer高通量組織研磨機，轉子-定子和cryogrinder的樣品的孔中存在顯著的熒光（較大分子量的分子片段）。
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figure 1. purified dna analyzed on 1% agarose gel (1x tae) with lambda-hindiii size markers. lane 1 - lambda hindiii digest lane 2 - ht homogenizer lane 3 - rotor-stator lane 4 - mortar and pestle lane 5 - cryogrinder lane 6 - lambda hindiii digest |
討論
一、根據不同均質化方法對dna產量，片段大小和純度影響，得出結果：
1. ht homogenizer高通量組織研磨機的dna產量最高，純度最佳。
2. cryogrinder低溫研磨產生了大片段dna，但產量和純度較低。
3. 轉子-定子具有良好的產率，但純度很低，片段最小。
4. 研缽和杵具有良好的dna片段，但dna純度相對較低，產量很低。
簡言之，沒有一個方法可達到dna的產量最高，純度最高，和片段最佳。
二、dna片段大小作為均質化的直接后果效果顯著
1. 轉子-定子依賴于旋轉刀剪切組織產生相對較小dna片段。
2. cryogrinder冷凍研磨器，通過粉碎和研磨，產生的相對大的dna片段。
3. ht homogenizer高通量組織研磨機和cryogrinder冷凍研磨器的粉碎顯然比轉子-定子剪切對dna的有害影響更小。
4. 在微量樣品中，研缽研磨難以收集粉碎樣品，得到 dna產量非常少。研缽和杵的這個產量問題是開發cryogrinder冷凍研磨器的最佳理由。
5. cryogrinder冷凍研磨器具有微型砂缽（約1/2英寸直徑），阻止粉碎樣品的擴散，并在研磨后得到有效的回收樣品。
三、不管來源如何，重要的是注意內在或外在因素會影響dna的最終純度
由不同均質方式產生的不同程度的樣品純度難以解釋（表2）。 勻漿后，所有樣品都加sds、蛋白酶k，然后用qiaamp dna mini kit純化。該試劑盒旨在去除雜質，結果基于260/280比為1.29至1.77?？赡苁?，轉子-定子、研缽和杵引入來自樣品外的污染物。而ht homogenizer高通量組織研磨機使用消耗性的試管和鋼珠，可避免污染。
四、根據應用，每種破碎方式都具有價值
對于微量樣品，cryogrinder冷凍研磨器產生較大的片段和良好的產量。
而ht homogenizer高通量組織研磨機通過撞擊可產生最大片段dna，通量高是ht homogenizer高通量組織研磨機的最大優勢。
五、越來越多的場合需要處理低溫保存的細胞和生物樣品
溫度敏感的樣品（如原代和培養的細胞，蛋白質、rna）等如果加熱或解凍，會喪失生物活性。為了解決這個問題，opsd設計了cryocooler?，這是保存培養細胞和組織標本冷凍小瓶完整性的有價值的工具。這種便攜式低溫工作站可以與cryogrinder研缽和杵系統配對，以在低溫下研磨樣品并儲存運輸樣品。
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