急性缺血性卒中是一種由腦血管閉塞而引起的腦組織缺血及缺氧壞死，有可能造成毀滅性和永久性的中樞神經(jīng)損傷，這一病理過(guò)程涉及線粒體氧化磷酸化功能障礙和細(xì)胞生物能量應(yīng)激。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 (LRP1)是一種多功能的跨膜受體，可調(diào)節(jié)血腦屏障完整性、神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)、能量代謝等眾多細(xì)胞過(guò)程，但在缺血性卒中過(guò)程中的作用仍不明確。
2024年6月，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、四川大學(xué)華西醫(yī)院和中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)團(tuán)隊(duì)在Cell Metabolism上發(fā)表了題為“Astrocytic LRP1 enables mitochondria transfer to neurons and mitigates brain ischemic stroke by suppressing ARF1 lactylation”的研究論文，揭示了星形膠質(zhì)細(xì)胞中的LRP1通過(guò)抑制葡萄糖攝取、糖酵解和乳酸生成，導(dǎo)致ADP-核糖基化因子1 (ARF1)的乳酸化水平降低，進(jìn)而促進(jìn)了線粒體向受損神經(jīng)元的轉(zhuǎn)移，并緩解缺血導(dǎo)致的器官損傷。（麥特繪譜提供[U-13C]葡萄糖、[U-13C]L-谷氨酰胺、[U-13C]乙酸代謝流檢測(cè)服務(wù)）
技術(shù)路線圖
分析結(jié)果
1. LRP1缺失會(huì)抑制線粒體從星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)移
已有研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞可釋放健康的線粒體到鄰近的神經(jīng)元，以此來(lái)使受損的神經(jīng)元恢復(fù)健康。基于這一假設(shè)，研究者利用慢病毒轉(zhuǎn)染設(shè)計(jì)了LRP1敲減的星形膠質(zhì)細(xì)胞（記為shLrp1）。首先觀察到培養(yǎng)基中細(xì)胞外線粒體數(shù)量降低，且伴隨耗氧量和ATP減少，說(shuō)明敲減LRP1抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放線粒體；隨后分離星形膠質(zhì)細(xì)胞中的線粒體，將之與神經(jīng)元共培養(yǎng)，熒光顯微鏡證實(shí)，敲減LRP1抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體向神經(jīng)元轉(zhuǎn)移；最后進(jìn)行氧-糖剝奪（OGD）和恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲減LRP1后的新型膠質(zhì)細(xì)胞失去了恢復(fù)神經(jīng)元活性的能力。
圖1. LRP1促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體向神經(jīng)元轉(zhuǎn)移
2. LRP1缺失會(huì)增加星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖酵解及乳酸水平
線粒體在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮著核心作用，因此研究者推測(cè)LRP1介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移可能與能量代謝有關(guān)。基于此對(duì)shLrp1及對(duì)照的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)shLrp1細(xì)胞內(nèi)，葡萄糖、糖酵解中間產(chǎn)物：甘油醛3-磷酸和乳酸，以及部分TCA中間體的水平上升，同時(shí)ECAR/OCR比率及ATP生成速率也顯著增加。表明敲減LRP1后，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)糖酵解相對(duì)于氧化磷酸化增強(qiáng)。
為進(jìn)一步確認(rèn)糖酵解增強(qiáng)是否由葡萄糖攝取的增加引起，研究者使用[U-13C]葡萄糖進(jìn)行代謝流檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲減LRP1顯著增加了星形膠質(zhì)細(xì)胞的葡萄糖攝取。隨后研究者試圖用同樣的方法確認(rèn)增加的乳酸是否來(lái)源于糖酵解：使用[U-13C]葡萄糖、[U-13C]L-谷氨酰胺或[U-13C]乙酸分別標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，追蹤并分析13C進(jìn)入乳酸及TCA循環(huán)代謝物中的情況（代謝流技術(shù)由麥特繪譜提供）。結(jié)果顯示，大多數(shù)乳酸由葡萄糖生成，同時(shí)敲減LRP1提高了星形膠質(zhì)細(xì)胞中的乳酸水平。
圖2. 敲減LRP1可增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖酵解和乳酸代謝
3.乳酸抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放功能性線粒體
接下來(lái)試圖確定乳酸的增加是否影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體釋放。作者分別抑制了能量代謝過(guò)程中可調(diào)節(jié)乳酸生成的不同環(huán)節(jié)，隨后觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)乳酸、細(xì)胞外線粒體及ATP等指標(biāo)的變化。這些抑制實(shí)驗(yàn)包括：
● 缺氧處理，誘導(dǎo)無(wú)氧糖酵解發(fā)生
● 魚(yú)藤酮處理，抑制線粒體呼吸鏈，即氧化呼吸過(guò)程
● 2-DG處理，抑制糖酵解從而抑制乳酸上游的丙酮酸合成
● LDHA/B選擇性抑制劑，抑制乳酸脫氫酶活性，干擾乳酸生成
● 敲除Ldha和Ldhb基因，完全阻斷乳酸和丙酮酸的相互轉(zhuǎn)換
圖3. 調(diào)節(jié)乳酸產(chǎn)生的各種代謝調(diào)節(jié)劑
結(jié)果表明，抑制丙酮酸合成或者抑制乳酸脫氫酶活性后，均觀察到乳酸生成減少，并伴隨著細(xì)胞外線粒體和ATP水平的增加。進(jìn)一步地，為了測(cè)試乳酸是否調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體釋放，使用梯度劑量的乳酸培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)乳酸處理以劑量依賴的方式降低細(xì)胞外線粒體和ATP水平。
圖4. 乳酸抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放線粒體
綜上，這些發(fā)現(xiàn)表明LRP1通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中的乳酸增加線粒體釋放。
4. ARF1 K73乳酸化介導(dǎo)LRP1誘導(dǎo)的線粒體釋放
已知乳酸分子可以與蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基發(fā)生酯鍵結(jié)合，即發(fā)生蛋白的乳酸化修飾，因此研究者假設(shè)LRP1可能是通過(guò)乳酸化修飾來(lái)發(fā)揮作用。利用乳酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)shLrp1和對(duì)照星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，共鑒定到136個(gè)差異修飾蛋白和163個(gè)差異修飾位點(diǎn)，其中細(xì)胞質(zhì)中乳酸化程度最高的是ARF1 (ADP-核糖基化因子1)的第73位賴氨酸。接下來(lái)對(duì)該蛋白進(jìn)行功能分析，從基因本體注釋的分子功能和細(xì)胞成分方面來(lái)看，ARF1與LRP1的功能相似性最高；且蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析也發(fā)現(xiàn)ARF1在線粒體釋放中具有潛在的功能。
為進(jìn)一步驗(yàn)證ARF1-kla73是否是線粒體釋放的關(guān)鍵介質(zhì)，對(duì)ARF1的73號(hào)位賴氨酸位點(diǎn)進(jìn)行了突變：突變?yōu)楣劝滨０返腒73Q（激活乳酸化）和突變?yōu)榫彼岬腒73R（抑制乳酸化）。隨后觀察到K73R突變體的ARF1活性受到抑制，且伴隨線粒體釋放上調(diào)的現(xiàn)象。反之，激活乳酸化修飾的K73Q突變體則會(huì)抑制線粒體的釋放。
圖5. ARF1 K73乳酸化介導(dǎo)的LRP1誘導(dǎo)-線粒體釋放
以上結(jié)果說(shuō)明，乳酸通過(guò)ARF1-Kla73減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體釋放。
5. 體內(nèi)驗(yàn)證LRP1-乳酸軸與線粒體轉(zhuǎn)移和腦損傷的關(guān)系
最后進(jìn)行動(dòng)物模型驗(yàn)證，采用大腦中動(dòng)脈閉塞術(shù)(MCAO)構(gòu)建小鼠腦缺血再灌注（I/R）損傷模型，發(fā)現(xiàn)敲減LRP1的小鼠在MCAO手術(shù)后腦梗死區(qū)域更大，神經(jīng)功能也更差。此外，在梗死區(qū)域邊緣的神經(jīng)元內(nèi)線粒體數(shù)量、特別是來(lái)自星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體減少，并且這些神經(jīng)元的線粒體功能受損。
圖6. LRP調(diào)控的星形細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)移可減輕腦I/R損傷
隨后進(jìn)一步測(cè)試了上述腦損傷過(guò)程中ARF1-K73乳酸化的作用。首先，分別對(duì)LRP1特異性敲減的小鼠進(jìn)行K73Q和K73R過(guò)表達(dá)造模，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，K73R過(guò)表達(dá)小鼠腦脊液和神經(jīng)元中星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的線粒體更多，K73Q過(guò)表達(dá)組則與之相反。隨后再次進(jìn)行MCAO誘導(dǎo)的腦損傷實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，K73R處理組小鼠梗死面積減少，神經(jīng)功能改善，星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的線粒體數(shù)增加，而K73Q處理組的表型變化與之相反。
為了確定上述研究結(jié)果的臨床相關(guān)性，研究者量化了人類卒中患者和正常受試者的腦脊液乳酸水平，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照相比，缺血性腦卒中患者腦脊液乳酸水平明顯升高，且乳酸水平與梗死面積呈正相關(guān)，而與腦脊液星形細(xì)胞線粒體呈負(fù)相關(guān)。
圖7. 星形膠質(zhì)細(xì)胞的ARF1-K73乳酸化會(huì)減少線粒體轉(zhuǎn)移，從而加重腦I/R損傷
以上結(jié)果支持了乳酸可降低線粒體轉(zhuǎn)移并加重腦I/R損傷的結(jié)論。
研究結(jié)論
本研究使用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定同位素示蹤（代謝流）檢測(cè)和乳酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)等技術(shù)方法，研究了星形膠質(zhì)細(xì)胞LRP1調(diào)節(jié)健康線粒體從星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)移，并保護(hù)免受腦缺血再灌注(I/R)損傷的現(xiàn)象。在機(jī)制方面發(fā)現(xiàn)了乳酸鹽抑制功能性線粒體轉(zhuǎn)移并加重I/R損傷。
本研究為理解線粒體穩(wěn)態(tài)缺血性卒中發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制提供了新的視角，為開(kāi)發(fā)缺血性卒中的治療提供了新的策略。
圖8. 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
Zhou J, Zhang L, Peng J, et al. Astrocytic LRP1 enables mitochondria transfer to neurons and mitigates brain ischemic stroke by suppressing ARF1 lactylation. Cell Metab. 2024.
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繪譜幫你測(cè)
麥特繪譜為本研究提供[U-13C]葡萄糖、[U-13C]L-谷氨酰胺、[U-13C]乙酸代謝流檢測(cè)技術(shù)。本公司開(kāi)創(chuàng)性地搭建了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域高端代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，覆蓋了非靶向-全定量-代謝流等全方位的高端醫(yī)學(xué)代謝組解決方案，同時(shí)全面布局微生物組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)服務(wù)，已成為全球多組學(xué)研究者的優(yōu)選合作伙伴。麥特繪譜擁有Q1000，Q500、Q300、Q200和膽汁酸、短鏈脂肪酸、色氨酸及吲哚衍生物、多胺和TMAO類等各類小分子代謝物、非靶向代謝組學(xué)和同位素示蹤代謝流技術(shù)等共40+系列檢測(cè)方法；已為數(shù)百家三甲醫(yī)院、科研院所和企業(yè)提供多組學(xué)解決方案，協(xié)助客戶與合作伙伴發(fā)表SCI文章400+篇，累計(jì)影響因子4000+，平均IF＞10，包括Cell, Nature, Science, Cell Metabolism, Immunity, Gut, Hepatology, Microbiome等頂級(jí)期刊。
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